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全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）是甲基化研究的重要技术。尽管已经开发了一系列工具来解决由亚硫酸盐处理引起的比对问题，但尚未对最新可用工具的reads比对性能以及多种哺乳动物的生物学解释（biological interpretation）进行评估。在此基础上，本文对人、牛和猪等三种哺乳动物真实和模拟WGBS生成的14.77 billion reads数据进行936次比对，以测试和评估14种常用的标准分析比对软件，分别为Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Walt、Abismal、Batmeth2、Hisat_3n、Hisat_3n_repeat、Bismark-bwt2-e2e、Bismark-his2、BSSeeker2-bwt、BSSeeker2-soap2、BSSeeker2-bwt2-e2e和BSSeeker2-bwt2-local。

具体而言，与其他九种比对软件相比，Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt五种软件表现出更高的唯一比对reads、比对精确率、召回率和F1-score，不同比对软件对甲基化的影响在CpG位点数量和甲基化水平、calling差异甲基化CpG（DMC）和差异甲基化区域（DMR）上有很大差异。尤其是BSMAP比对软件在检测CpG位点和甲基化水平、DMC/DMR/DMR相关基因和信号通路的calling方面表现出最高的准确性。

图1：哺乳动物14种比对软件的标准分析方案

材料方法

（1）模拟数据的生成

从UCSC下载了人、牛和猪的参考基因组，其基因组大小、组装质量和基因数量各不相同（表1）。基于三种哺乳动物的参考基因组，使用Sherman生成模拟的WGBS数据（Sherman是Babraham开发的具有特定参数的WGBS数据模拟器）。

表1：人、牛和猪参考基因组组装

模拟对运行时间、占用内存、唯一比对reads、比对精确率、召回率和F1-score进行标准分析测试，使用Sherman模拟数据集A生成了45个模拟数据样本（5个测序错误率×3个哺乳动物×3个重复）。5种测序错误率分别为0、0.25%、0.5%、0.75%和1.00%；3种哺乳动物为人、牛和猪；每种哺乳动物的每个测序错误率生成3个重复。总共使用了45个模拟数据样本和630次比对来对14个比对软件进行标准测试。每个模拟数据样本均生成2M reads覆盖，因此45个模拟数据样本共生成90M reads。

为进一步研究比对性能以及重复序列和CGI对比对软件比对率的影响，又生成了包含18个数据样本的模拟数据集B（2个测序错误率×3个哺乳动物×3个重复），每个样本的reads数约为93.8M。2个测序错误率分别为0和1.00%，共生成约1.64 billion reads数据。

两组模拟数据集研究均未对包括CpG位点、DMC/DMR/DMR相关基因和信号通路calling的甲基化生物学解释进行标准分析。

（2）真实WGBS数据

从国家生物技术信息中心（NCBI）数据库的序列reads档案中下载了人、牛和猪的真实WGBS数据。真实数据集A包含9个数据样本（3个哺乳动物×3个重复）。每个样本覆盖2M reads，共生成18M reads，用于评估运行时间、内存消耗和唯一比对reads。

真实数据集B包含18个数据样本（3个哺乳动物×2组×3个重复）。两组分为第1组和第2组，每组3个生物学重复。人的数据来自精神分裂症患者和正常人的大脑；牛的数据来自6头公牛背最长肌；猪的数据来自长白猪的骨骼肌。真实数据集B中样本的测序深度大于30X，共生成13.1 billion reads用于分析比对软件对生物学解释下游分析的影响，如CpG位点、DMC/DMR/DMR基因和信号通路。

分析结果

（1）比对软件的运行时间和内存使用成本

为了对这14种比对软件的比对效率进行标准测试分析，使用模拟数据集A和真实数据集A计算运行时间和内存消耗。结果发现Walt软件速度最快，而BSSeeker2-bwt2-local是在测序错误率分别为0%、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%下的最慢软件（图2a）。Bwa-meth、Hisat_3n、Hisat_3n_repeat、BSBolt、BSMAP和Bismark-his2的运行时间与人、牛和猪这三种哺乳动物中分别为0、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%的测序错误率呈正相关（Pearson相关系数≥0.7，P<0.05）（图2b）。BSSeeker2-bwt2-e2e、Batmeth2、BSSeeker2-bwt2-local和Abismal的平均运行时间比Walt、BSMAP、Bwa-meth、Bismark-his2、BSSeeker2-soap2、BSSeeker2-bwt、Bismark-bwt2-e2e、BSBolt、Hisat_3n和Hisat_3n_repeat的平均运行时间分别长5.38倍（模拟数据）和3.36倍（真实数据）（学生t检验，P＜2.67e-12）（图2c）。

图2：基于模拟数据集A和真实数据集A的14种比对软件的运行时间和内存消耗。

模拟数据集A中五种测序错误率的14种比对软件的运行时间（左）和内存消耗（右）。

模拟数据集A中14种比对软件的测序错误率与性能之间的Pearson相关系数（如运行时间、内存消耗、唯一比对reads，比对的精确率和召回率）。

模拟数据集A（左）和真实数据集A（右）中14种比对软件的平均运行时间。

模拟数据集A（左）和真实数据集A（右）中14种比对软件的平均内存消耗。

将模拟数据和实际数据结果进行平均，除了Batmeth2、BSSeeker2-bwt2-local和Abismal软件外，其他比对软件的运行时间在人、牛和猪物种之间没有显著变化（图2c）。BSSeeker2-soap2软件分别比BSSeeker2-bwt、BSSeeker2-bwt2-e2e、BSSeeker2-bwt2-local软件快2.72、5.78和8.95倍（学生t检验，P<3.7e-09）；Bismark-his2软件比Bismark-bwt2-e2e软件快2.27倍（学生t检验，P<9.5e-07）；Bismark-bwt2-e2e软件比BSSeeker2-bwt2-e2e软件快2.04倍（学生t检验，P<2.3e-09），表明不同的比对软件表现出不同的运行时间。

此外，在分别为0、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%的测序错误率中，Walt占用内存最多，而BSSeeker2-bwt2-local占用内存最低，这与Walt和BSSeeker2-bwt2-local的运行时间不一致（图2a）。Bwa-meth和BSBolt所占内存与人、牛和猪分别为0、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%的测序错误率高度正相关（Pearson相关系数≥0.7，P<0.05，图2b）。BSSeeker2-soap2、BSMAP、Bwa-meth、Walt、Batmeth2、Hisat_3n、Hisat_3n_repeat和BSBolt软件在人类、牛和猪中所占内存分别是BSSeeker2-bwt、Bismark-bwt2-e2e、BSSeeker2-bwt2-e2e、BSSeeker2-bw2-local、Bismark-his2和Abismal的3.29倍（模拟数据）和3.30倍（真实数据）（学生t检验，P＜2.2e-16，图2d）。且这些比对软件的内存随着人、牛和猪的基因组大小而减少（图2d）。将模拟数据和真实数据的结果进行平均，BSSeeker2-soap2所占内存分别是BSSeeker2-bwt、BSSeeker2-bwt2-e2e和BSSeeker2-bwt2-local的2.19倍、2.02倍和2.02倍；Bismark-his2所占内存是Bismark-bwt2-e2e的1.33倍（学生t检验，P＜7.37e-06）。这些结果表明，soap2和his2比对软件比bwt、bwt2-e2e和bwt2-local占用更多内存。

（2）比对软件的唯一比对reads、比对精确率（mapped precision）、召回率（recall）和F1-score

为了研究比对软件的比对性能，利用不同比对软件对模拟数据集A的唯一比对reads、比对精确率、召回率和F1-score进行分析。计算公式如下：

结果发现BSSeeker2-bwt2-2e分别为0、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%的测序错误率在三个基因组中表达的唯一比对reads最少，而Bwa-meth表现的最多（图3a）。测序错误率与Hisat_3n_repeat、Hisat_3n、Walt、BSSeeker2-soap2、BSSeeker2-bwt2-local、Batmeth2和BSSeeker2-bwt2-e2e唯一比对的reads数呈高度负相关（Pearson相关系数≤-0.7，P＜0.05，图2b）。Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Hisat_3n、Hisat_3n_repeat、Abismal、Bismark-bwt2-e2e和Walt的唯一比对reads率比其他比对软件高22.68%（（学生t检验，P＜2.2e-16，图3b）。与人物种相比，除了Batmeth2、Hisat_3n_repeat、Bwa-meth和BSBolt外，其他比对软件在牛和猪物种中显示出更高比例的唯一比对reads（图3b）。值得一提的是，BSSeeker2的四种软件软件显示相似的唯一比对reads，但Bismark-bwt2-e2e表现出的唯一比对reads比Bismark-his2多11.00%（图3b）。而在真实数据中没有观察到这些情况（图3c）。

图3：14种比对软件对模拟数据集A和真实数据集A的唯一比对reads、映射精确率、召回率和F1-score分析

模拟数据集A中五个测序错误率的唯一比对reads。

模拟数据集A中这些比对软件的唯一比对reads平均比例。

真实数据集A中这些比对软件的唯一比对reads平均比例。

模拟数据集A中这些比对软件的平均比对精确率和召回率。

模拟数据集A中这些比对软件的平均 F1-score。

模拟数据集 A 中唯一比对reads和F1-score的平均率。

此外，Walt表现出最高的比对精确率和召回率，而BSSeeker2-bwt2-local表现出最低的比对精确率和召回率（图3d）。除了BSSeeker2-bwt外，其他比对软件的比对精确率和召回率与测序错误率呈高度负相关（Pearson相关系数≤-0.7，P<0.05）（图2b）。此外除了BSSeeker2-bwt2-local和Batmeth2外，大多数比对软件在三个基因组中的平均F1-score均>90%，BSSeeker2-bwt2-local的F1-score至少比BSSeeker2-soap2、BSSeeker2-bwt和BSSeeker2-bwt2-e2e低21.64%，而Batmeth2和BSSeeker2-bwt2-local在模拟数据的F1-score上表现较差（图3e），但在真实数据中唯一比对reads上表现出优异的性能（图3c）。三个基因组中的平均唯一比对reads和F1-score结果，显示Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt的唯一比对reads率和F1-score均>90%（图3f）。因此后续分析的重点将放在Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt上，以进一步研究其在WGBS数据生物学解释中的表现。

（3）重复序列和CGI对比对性能的影响

由于Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt在唯一比对reads和F1-score方面表现突出，使用模拟数据集B进一步研究这五种软件的比对性能。结果发现Bwa-meth表现出最少的比对reads数，而Walt表现出最多低质量比对reads（图4a）。测序错误率从0增加到1.00%，BSMAP、BSBolt、Bwa-meth、Bismark-bwt2-e2e和Walt的比对reads分别增加了0.053%、1.95%、0.144%、1.321%和5.651%（图4a）。在测序错误率为0和1.00%的情况下，Bwa-meth的比对reads仅由不正确的唯一比对reads组成（图4a）。与牛和猪物种相比，人物种在五种比对软件中的比对reads更多低质量（P<0.0013，图4a）。且9.2%-53%的低质量比对reads与这五种比对软件中的reads数相同。这一结果反映了这五种比对软件的不同比对性能。

图4：重复序列和CGI对模拟数据集B中5种比对软件比对性能的影响

Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt的低质量比对reads的比例和类别。

这五种比对软件在重复序列和非重复序列中的低质量比对reads比例。

这五种比对软件在CGI和非CGI中的低质量比对reads比例。

图5：Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt对真实数据集B中CpG位点和甲基化水平的影响。

Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt分别检测到的CpG位点数。

通过五种或四种比对软件一致检测到的共同CpG位点数量。

Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt检测到的准确CpG位点比例。

通过四个或三个比对软件一致检测到的共同CpG位点数量。

Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt检测到的准确CpG位点比例。

一致和不一致的CpG位点的比例。

CGI、非CGI、重复序列和非重复序列中一致和不一致CpG位点的比例。

一致和不一致CpG比例的高、中、低甲基化水平。

Bwa：Bwa-meth；BSM：BSMAP；Bis：Bismark-bwt2-e2e；Wal：Walt；BSB：BSBolt。

为研究基因组特征对低质量比对reads的影响，分析低质量的比对reads在重复序列和CGI的表征，结果发现在重复序列中表现出比在非重复序列中更低质量的比对reads（学生t-检验，P＜2.68e-05，图4b），且在CGI区域中发现比非CGI区域更低质量的比对reads（学生t-检验，P＜9.59e-05，图4c）。与非重复序列相比，在Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt比对软件中，人物种的重复序列低质量比对reads富集度为1.43、1.33、1.41、1.29和1.38，牛物种为4.06、4.29、4.37、2.82和3.03；猪物种为1.70、1.69、1.59、1.50和1.55（Fisher精确检验，P＜2.2e-16）（图4b）。此外与非CGI相比（图4c），在Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt比对软件中，CGI中低质量比对reads在人物种中的富集度为1.67、1.76、1.64、1.67和1.76，牛物种为3.18、2.70、2.23、2.56和2.00，猪物种为1.99、2.06、1.66、1.65和1.69（Fisher精确检验，P＜2.2e-16）。这些观察结果表明重复序列和CGI区域导致了低质量的比对reads。

（4）比对软件对CpG位点和甲基化水平的影响

通过Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt比对软件对真实数据集B 种CpG位点≥10reads覆盖的甲基化谱进行评估，发现BSBolt在人（28551216）、牛（36661360）和猪（31884976）中calling的CpG位点最多；Walt在人（17326301）、牛（20956144）和猪（18884561）中calling的CpG含量最低（图5a）。在人物种中（图5b），这五种比对软件一致检测到8182827个CpG位点，但在去除BSBolt后，Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt一致检测到的CpG位点增加了170.63%（13962703）。该结果表明BSBolt软件是造成人、牛、猪物种中缺乏一致性CpG位点的原因（图5b）。此外BSMAP在检测CpG位点时表现出最高的准确度（人：15411076，99.37%；牛：14252815，98.99%；猪：14272746，99.03%），而BSBolt的准确度最低（人：9728719，62.73%；牛：6143665，42.67%；猪：6316216，43.82%）（图5C）。由于BSBolt与其他四种软件在CpG位点上存在巨大差异，以下讨论将集中在Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt上。

就Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt而言，在去除Walt后，其他三个软件一致地检测到大部分CpG位点，因此可能Walt是导致这四种比对效率不一致的原因（图5d）。BSMAP表现出比其他三种软件更高的精确度（图5e）。通过四种比对软件分别在人、牛和猪中检测到26586835、29736425和28674654个CpG位点，其中约51.65%、42.02%和44.64%被检测为一致CpG位点（图5f）。此外CGI和重复序列在人、牛和猪中可能比非CGI和非重复序列保留更多不一致的CpG位点（学生t-检验，P<6.38e-03，图5g）。在人、牛和猪物种中，一致的CpG在低甲基化（<1/3）和高甲基化（>1/3）时可能过表达，但不一致的CpG可能在中等甲基化时表达下调（1/3~2/3）（学生t检验，P<0.02，图5h）。

（5）比对软件对DMC和DMR的影响

基于真实数据集B中包含≥10 reads覆盖的CpG位点，在Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt中评估了DMC和DMR的甲基化变化和动态。在这四种软件中，Bwa-meth软件calling的DMC最多（人：1366812；牛：2506659；猪：1747539），Walt软件calling的DMC最少（人：884427；牛：1702832；猪：850291）（图6a）。四种软件在人、牛和猪中一致鉴定出316048、631985和27238个DMC；Bwa-meth、BSMAP和Bismark-bwt2-e2e一致鉴定出最多的DMC（人：432724；牛：811088；猪：363085）；Bwa-meth、Bismark-bwt2-e2e和Walt一致鉴定出最少的DMC（人：334856；牛；669034；猪：289236）。在去除Walt后，其他三种比对软件一致鉴定最多DMC，表明Walt对DMC的一致性分析有所欠缺（图6b）。calling DMC时，BSMAP在人（551145，96.70%）、牛（1101408，96.74%）和猪（502505，96.75%）中显示出最高的准确度，而Walt在人（453277，79.53%）、牛（959354，84.27%）和猪（428656,82.54%）中显示出最低的准确度（图6c）。在人、牛和猪的重复序列中，一致性DMC的富集度分别为0.92、0.87和0.83（图6d，Fisher精确检验，P＜2.2e-16），表明一致性DMC可能在重复序列中不足，但对CGI没有明显的偏好（图6d）。

图6：Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt对真实数据集B中的甲基化动态影响

（a） Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt检测到的DMC数量。

（b） 多种比对软件共同检测到的一致性DMC数量。

（c） Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt检测到的准确DMC比例。

（d） CGI、非CGI、重复序列和非重复序列中一致和不一致的DMC比例。

（e） Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt检测到的DMR长度。

（f） 多种比对软件一致检测到的DMR长度。

（g） Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt检测到的准确DMR比例。

（h） CGI、非CGI、重复序列和非重复序列中一致和不一致的DMR比例。

Bwa：Bwa-meth；BSM：BSMAP；Bis：Bismark-bwt2-e2e；Wal：Walt。

在Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt中，calling的最长DMR来自Bwa-meth的比对结果（人：109239519 bp，牛：123175355 bp，猪：120202580 bp），calling的最短DMR来自Walt的比对结果（人：77387750 bp，牛：94239118 bp，猪：79180616 bp）（图6e）。Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt分别在人、牛和猪中共同鉴定出30530480bp、33100297bp和25135110bp的DMR（图6f）。在通过三种软件共同鉴定的DMR中，去除Walt后，Bwa-meth、BSMAP和Bismark-bwt2-e2e共同鉴定的DMR最长（人：40957306 bp；牛：42379448 bp；猪：33330430 bp），表明Walt是缺乏一致性的原因（图6f）。BSMAP在人（50708843 bp，95.39%）、牛（56868993 bp，95.34%）和猪（953420 bp，94.86%）的DMR calling中表现出最高的准确度，而Walt在人（42734834 bp，80.39%）、牛（50368187 bp，84.44%）和猪（39014214 bp，82.64%）中表现出最低的准确度（图6g）。

这些一致性DMR在人、牛和猪的重复序列中的富集分别为0.74、0.74和0.86（图6h，Fisher精确检验，P＜2.2e-16），表明一致性DMR也可能在重复序列中不足，且对CGI没有明显的偏好（图6h）。为更好描述四种比对软件对全基因组DNA甲基化谱的影响，观察了SOX9基因在人类、MPZ基因在牛和IGF2BP3基因在猪中的甲基化谱（图7a-c），结果表明比对软件在CpG位点数量和甲基化水平、DMC数量和DMR长度方面生成了不同的甲基化谱。这些结果表明比对软件的选择对甲基化水平具有显著影响。

图7：Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt揭示基因的DNA甲基化谱

（a） SOX9基因是人对照组和精神分裂症之间差异表达最高的基因。

（b） MPZ基因是与牛胚胎过程Wnt信号通路相关的中枢基因。

（c） IGF2BP3基因是调节猪骨骼肌发育的关键基因。

（6）比对软件对生物解释（biological interpretation）的影响

上述结果表明这四种比对软件的选择对甲基化谱具有显著影响。为了进一步探索比对软件对WGBS数据生物学解释的影响，基于真实数据集B提取DMR相关基因，并通过KEGG富集分析解释和鉴定Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt比对分析的生物学功能。结果发现Bwa-meth在人（32055）、牛（17762）和猪（22510）中检测到最多的DMR相关基因，而Walt在人（28446）、牛（16841）和猪（20444）中检测到最少的DMR相关基因（图8a）。Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt在人（25161）、牛（15409）和猪（17967）中共同鉴定出25161个一致性DMR相关基因（图8b）。在通过三种软件共同鉴定的一致性DMR相关基因中，去除Walt，Bwa-meth、BSMAP和Bismark-bwt2-e2e在人（26638）、牛（15893）和猪（18935）鉴定出最多的DMR相关基因（图8b），表明Walt在calling DMR相关基因方面缺乏一致性。对于calling DMR相关基因的准确性，BSMAP在人（27948,98.68%）和牛（16584,99.00%）中最高，Bwa-meth在猪中最高（20011,98.28%），但Walt在人（26846,94.78%）、牛（16267,97.11%）和猪（19392,95.24%）中均最低（图8c）。

图8：Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt对真实数据集B中生物学解释的影响.

（a） Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt检测到的DMR相关基因数量。

（b） 通过多种比对软件共同检测到的一致性基因数量。

（c） Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt检测到的准确DMR相关基因比例。

（d） Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt检测到的信号通路数量。

（e） 通过多种比对软件共同检测到的一致性通路数。

（f） Bwa-meth、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt检测到的准确通路比例。

Bwa：Bwa-meth；BSM：BSMAP；Bis：Bismark-bwt2-e2e；Wal：Walt。

在DMR相关基因的KEGG分析中，分别在人、牛和猪中鉴定出140、223和223条通路（图8d），通过四种比对软件一致检测出约67、184和157条通路（图8e）。在去除Walt后，其他三种比对软件在人（75）和猪（167）中共同检测到最多的通路；去除Bwa-meth后，其他三种比对软件在牛（189）中共同检测到最多的通路（图8e）。此外，BSMAP在信号通路的calling中表现出最高的准确性（人：86，95.56%；牛：197，99.49%；猪：181，97.84%），Walt在信号通路的calling中表现出最低的准确性（人：82，91.11%；牛：194，97.98%；猪：175，94.59%）（图8f）。

最后分析了四种比对软件中每种软件富集度最高通路的TOP 30。在人物种中，所有四种软件一致地解释了15个（50.00%）信号通路，如粘着斑（Focal adhesion）、轴突导向（Axon guidance）、产热（and Thermogenesis），但其中两种软件可以一致检测到的信号通路数量范围为18~22个（60%-73.33%）。在牛中，所有四种软件都解释了16个（53.33%）信号通路（如MAPK信号通路、肝细胞癌和轴突导向），但四种软件中的两种一致检测到的信号通路数量范围为21~24个（70%-80.00%）。在猪中，所有四种软件都解释了15个（50.00%）信号通路，如内吞作用（Endocytosis）、粘着斑、轴突导向，但四种软件中的两种一致检测到的信号通路数量范围为19~23个（63.33%-76.67%）。

结论

基于14.77 billion reads的真实和模拟WGBS数据，共进行936次比对，以标准化分析评估在人、牛和猪的甲基化研究中的14种常用的比对软件，包括运行时间，内存消耗，唯一比对reads、低质量比对reads、比对精确率、召回率和F1-score，以及在检测CpG位点和甲基化水平、calling DMC/DMR/DMR相关基因和信号通路的生物学解释准确性。

在模拟WGBS数据中，Bwa-meth、BSBolt、BSMAP、Bismark-bwt2-e2e和Walt比其他九种比对软件表现出更高的唯一比对reads，比对精确率、召回率和F1-score。在真实WGBS数据中，与Bwa-meth、BSBolt、Bismark-bwt2-e2e和Walt相比，BSMAP在检测CpG位点和甲基化水平、calling DMC/DMR/DMR相关基因和信号通路方面显示出最高的准确性。这些结果可以为研究人员提供比对软件选择的有用信息，并有助于提高哺乳动物DNA甲基化检测的准确性。

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全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因提供的全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

全基因组甲基化图谱课题

标志物筛选课题

小规模研究课题

技术优势：

应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；

全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；

单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因。

参考文献：Gong W, et al. Benchmarking DNA methylation analysis of 14 alignment algorithms for whole genome bisulfite sequencing in mammals. Comput Struct Biotechnol J. 2022;20:4704-4716.

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