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斑马鱼和人类基因有着87%的高度相似性，作为模式生物的优势很突出，意味着其实验结果大多数情况下适用于人体。在国际上，斑马鱼模式生物的使用正逐渐拓展和深入到生命体的多种系统（如神经系统、免疫系统、心血管系统、生殖系统等）的发育、功能和疾病（如神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等）的研究中，并已应用于小分子化合物的大规模新药筛选。目前，我国有250个以上的实验室利用斑马鱼开展相关科学研究。
本期易基因聚焦DNA甲基化在斑马鱼中的相关科学研究成果，并就DNA甲基化研究及多组学分析思路进行总结，一起来看看吧！
01 DNA甲基化影响造血干祖细胞产生的新机制
2022年5月3日，中国医学科学院血液病医院王璐研究团队和朱平团队合作在《Development》杂志发表了题为"DNA methylation safeguards generation of hematopoietic stem and progenitor cell by repression of Notch signaling"的研究论文。该研究利用斑马鱼模型，描绘了造血干祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs)产生过程中DNA甲基化的动态图谱，揭示了DNA甲基化通过抑制Notch信号通路促进造血干祖细胞产生的新机制。
标题：DNA methylation safeguards the generation of hematopoietic stem and progenitor cells by repression of Notch signaling.（DNA甲基化通过抑制Notch信号通路来影响造血干祖细胞产生）
时间：2022-05-03
期刊：Development
影响因子：IF 6.868
技术平台：WGBS、RNA-seq（易基因均可提供）
摘要：
在脊椎动物胚胎造血发育过程中，最早的造血干祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs)由生血内皮细胞（hemogenic endothelial cells, HECs）通过内皮-造血细胞转化（endothelial-to-hematopoietic transition, EHT）产生。Notch信号通路对脊椎动物产生HSPC至关重要；然而，在这个过程中，Notch的精确调控仍然不清楚。在本研究中，研究人员使用多组学方法（WGBS+RNA-seq）和功能分析来评估斑马鱼内皮细胞向HSPC转化期间的全基因组DNA甲基化动力学，并确定DNA甲基转移酶1（Dnmt1）通过抑制Notch相关基因对HSPC的产生至关重要。Dnmt1的缺失导致DNA甲基化水平降低和HSPC产生受损。在机制上，研究人员发现Dnmt1的缺失导致Notch相关基因的低甲基化，进一步提高血源性内皮细胞的Notch活性，从而抑制HSPC的产生。这一发现丰富了我们对体内HSPC产生机制的认识，为体外诱导获得可移植的造血干祖细胞提供新的思路。
方法与结果：
研究人员选取造血干细胞产生的关键时间点（36 hpf），分选内皮细胞（endothelial cells，ECs）、HECs和HSPCs，利用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和转录组测序（RNA-seq）技术进行深入分析。基于WGBS数据，研究人员鉴定了细胞类型特异的差异甲基化区域（DMRs），描绘了HSPC产生过程中DNA甲基化的动态图谱。进一步通过敲除和敲低Dnmt1降低DNA甲基化水平，发现HSPC产生缺陷，说明Dnmt1对HSPC发育至关重要。随后，通过WGBS和RNA-seq联合数据分析，鉴定出DNA甲基化与转录水平呈现负相关的基因主要富集于血管发育相关通路，尤其是Notch信号通路相关基因；体内实验证明缺失Dnmt1后动脉内皮基因的表达上升。进一步研究发现，DNA甲基化修饰通过抑制Notch信号通路，降低动脉内皮基因表达，促进HSPC产生，而在Dnmt1缺失后，Notch相关基因甲基化降低，表达增强，进而导致Notch活性升高，抑制HSPC产生。
图：Dnmt1介导的甲基化通过抑制Notch相关基因调控HSPC产生
02 DNA甲基化揭示亲本环境铜胁迫对子代发育异常的影响
2022年2月15日，华中农业大学李国亮团队在《Journal of Hazardous Materials》杂志发表了题为"Effects of parental environmental copper stress on offspring development: DNA methylation modification and responses of differentially methylated region-related genes in transcriptional expression"的研究论文。通过DNA甲基化测序和对应的转录组分析揭示铜诱导的精子DNA甲基化和转录组变化可以传递给受精子代，促使胚胎发生的表观遗传和转录调控重编程，从而导致胚胎发育缺陷。
标题：Effects of parental environmental copper stress on offspring development: DNA methylation modification and responses of differentially methylated region-related genes in transcriptional expression（亲本环境铜胁迫对子代发育的影响：DNA甲基化修饰和差异甲基化区域相关基因在转录表达中的反应）
时间：2022-02-15
期刊：Journal of Hazardous Materials
影响因子：IF 10.588
技术平台：DNA甲基化测序、转录组测序（易基因均可提供）
摘要：
亲本环境中铜（Cu）暴露广泛存在，很容易导致鱼类种群出现可持续性问题，表观遗传学被认为是该过程的基础，但其机制鲜有报道。本研究描述了亲本环境铜暴露对斑马鱼子代发育异常的影响。首次证明了：
1、铜胁迫的父系成年斑马鱼的子代表现出神经和消化系统的发育缺陷及转录组变化；
2、铜诱导的精子DNA甲基化和转录组的改变可诱导子代DNA甲基化的位点特异性改变和相关基因转录变化；
3、pmpcb，crebl2和tab2启动子区域的差异甲基化位点在其转录中起关键作用；
4、pmpcb，crebl2和tab2是亲本铜暴露引起的子代神经系统，视网膜和消化系统发育缺陷的关键基因。
这些数据表明，Cu诱导的精子DNA甲基化和转录组变化可以传递给受精子代，促使胚胎发生的表观遗传和转录调控重编程，从而导致胚胎发育缺陷。表明环境中的Cu可能对鱼类的可持续性构成巨大威胁。
图：研究摘要
03 DNA甲基化通过去记忆化构建早期胚胎发育的表观屏障
2021年 12月22日，清华大学生命科学学院颉伟课题组在《Science Advances》期刊在线发表了题为“Methylome inheritance and enhancer dememorization reset an epigenetic gate safeguarding embryonic programs”的研究论文。揭示了斑马鱼早期胚胎发育中DNA甲基化的调控作用。
标题：Methylome inheritance and enhancer dememorization reset an epigenetic gate safeguarding embryonic programs（DNA甲基化遗传和增强子去记忆化重塑表观屏障保障胚胎发育）
时间：2021-12-24
期刊：Science Advances
影响因子：IF 14.136
技术平台：微量DNA甲基化测序、RNA-seq、scRNA-seq、CUT&RUN、ChIP-seq、ATAC-seq（易基因均可提供）
脊椎动物的基因组大部分区域通常都是高甲基化的，而只有调控序列会出现低甲基化，并且这种低甲基化与调控序列的活性通常正相关。先前研究结果表明，基因组上的一类重要调控元件增强子在斑马鱼配子受精前后会从低甲基化的状态变成高甲基化的状态，从而去掉亲本的表观遗传学记忆（低甲基化状态）。这种现象被命名为增强子的去记忆化 (dememorization)。直到种系特征性发育阶段（斑马鱼胚胎受精后24小时），增强子的DNA甲基化才会被合子表达的TET蛋白特异性地擦除，从而激活下游的细胞特异基因的表达。然而，斑马鱼维持整体甲基化并且增强子去记忆化的功能，以及胚胎增强子如何在高DNA甲基化的基因组环境下激活下游基因表达仍是未解之谜。
在本研究中，作者利用未成熟卵母细胞原位显微注射技术（OMIS），在斑马鱼中建立了DNA甲基转移酶dnmt1的母源敲低模型，证明了全基因组范围内大幅度降低斑马鱼早期胚胎的DNA甲基化水平会导致早期胚胎致死。这些结果表明，高DNA甲基化是斑马鱼早期胚胎正常发育所必需的。为了研究DNA甲基化擦除引起胚胎致死的原因，研究人员检测了dnmt1母源敲低胚胎的转录组、组蛋白修饰在基因组内的分布变化。结果显示，DNA甲基化的降低伴随着成体细胞增强子和成体细胞特异表达基因的异常激活，提示增强子的去记忆化以及整体DNA甲基化对维持是沉默体细胞增强子的重要机制。
进一步研究发现，斑马鱼早期胚胎的增强子区域CG密度低，使其对DNA甲基化不敏感，而成体细胞的增强子区域CG密度高。所以，在斑马鱼早期胚胎中，高DNA甲基化能够选择性沉默成体细胞的增强子，保障了转录组的时序性。基于以上结果，研究人员揭示了整体DNA甲基化的维持和增强子的去记忆化是斑马鱼早期胚胎发育的转录程序的重要保障，能够防止成体细胞基因的提前激活，调控基因有序表达。
图：斑马鱼DNA甲基化遗传和增强子去记忆化重塑表观屏障保障胚胎发育
基于上述研究结果，研究人员提出一个模型来解释哺乳动物和其他的脊椎动物为什么采用了不同的DNA甲基化重编程模式。哺乳动物和非哺乳动物可能都是通过改变DNA甲基化水平去除亲本记忆。哺乳动物通过大规模擦除基因组DNA甲基化去除亲本记忆，而斑马鱼等非哺乳动物则通过甲基化增强子区域来去除亲本记忆，最终都达到了重置发育时钟的目的。这项工作不仅回答了斑马鱼早期胚胎发育中DNA甲基化的调控作用，同时加深了我们对于细胞重编程以及全能性获取的理解。
图：哺乳动物和非哺乳动物分别利用DNA甲基化整体擦除重建以及维持高DNA甲基化并实现增强子去记忆化擦除亲本表观遗传记忆和重置发育时钟
DNA甲基化研究及多组学分析思路
（1）DNA甲基化研究思路
DNA甲基化研究一般遵循三个步骤进行数据挖掘。
- 首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析（WGBS、RRBS等方式），包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。
- 其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。
- 最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。
- 多组学关联分析方法总结
- 直接关联
一个基因的功能元件甲基化情况影响该基因的表达。
• 重叠分析
• Pearson/Spearman 相关性分析
- 模型关联
基于基因转录、蛋白质、代谢物等之间的上下游相互作用联系。
• 多元线性模型(multiple linear model)
- 网络关联
基于分子功能和通路的富集性。
• WGCNA module correlation
• EMDN algorithm
• SNF algorithm
（3）从关联走向因果：组学分子实验验证
- 基因表达相关的组学：
基因敲除/抑制
基因过表达
- 甲基化组学：
甲基化酶基因的敲除与过表达
- 宏基因组（肠道菌群）：
无菌动物模型
粪菌移植
参考文献：
- 国家斑马鱼资源中心http://www.zfish.cn/Article/4762.html
- doi: 10.1242/dev.200390
- doi: 10.1016/j.jhazmat.2021.127600
- 清华大学https://life.tsinghua.edu.cn/info/1131/3516.htm
- DOI:10.1126/sciadv.abl3858
Nature | 易基因DNA甲基化测序助力人多能干细胞向胚胎全能8细胞的人工诱导
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