利用单分子技术进行生物研究

光镊在生命科学中的应用

专业：测控技术与仪器

 

天津大学精密仪器与光电子学院

二零一九年十一月

前  言

在大一时我就有一个疑惑，测控技术与仪器专业为什么要学生命科学与生物技术导论课，当时课本的前言写道‘学科交叉点往往就是科学新的生长点、新的科学前沿, 这里最有可能产生重大的科学突破, 使科学发生革命性的变化。’，我对这句话一知半解，感觉开设这门课实在是没有什么用。

在学习单分子技术课后，胡春光老师在单分子课堂上讲到利用光镊技术进行生物研究，以中科大李银妹教授用光镊在活体动物体内去除血栓例，为我们生动的讲解了光镊可以做到对单细胞的操作，甚至可以操纵DNA，我觉得这是我学习单分子技术后最有收获的地方，原来测控技术与仪器专业不仅可以研究仪器，不仅可以进行测量控制，还能利用设计的仪器在更多更广的领域内做研究。光镊在生命科学领域所做的，正是学科交叉点带来的科学革命，在16世纪末显微镜被发明后，我们终于能做到梦寐以求的事情：不仅可以看到细胞，还能操作细胞。我对单分子技术与生命科学兴趣很大，因此选择这一方面完成调研。

目  录

第一章         光镊简述... 4

1.1       光镊的发展... 4

1.2       光镊原理... 4

1.3       传统光镊装置... 6

1.4       光镊分类... 6

1.4.1      全息光镊... 6

1.4.2      等离子体光镊... 6

1.4.3      波导光镊... 7

1.4.4      光纤光镊... 7

1.5 光镊特点... 7

第二章  光镊在生物体内的研究... 7

2.1 利用光镊进行手术的猜想与困难... 7

2.2 光镊在活体细胞内操控的研究... 9

2.2.1 活体微环境下细胞对细菌的行为... 9

2.2.2 活体微环境下对药物微粒的操控... 10

2.2.3 活体微环境下对细胞的操控... 10

2.2.4对脊椎动物耳石的操控... 11

2.3 总结和畅想... 12

第三章  光镊对生物大分子的研究... 13

3.1 光镊对蛋白质的研究... 13

3.2 光镊对DNA的研究... 13

3.3 光镊与其他技术的结合... 14

3.3.1光镊与sm FRET技术结合... 14

3.3.2 光镊与拉曼光谱技术结合... 15

3.4 总结... 15

第四章  其他单分子力谱检测系统... 16

4.1 原子力显微镜... 16

4.2 磁镊... 17

4.3 生物膜力学探针... 17

第五章  课程收获与建议... 18

参考文献... 20

• 光镊简述
  1. 光镊的发展

光镊也称为单光束粒子阱，1986年Ashkin等人首次利用单束强聚焦激光形成的光阱实现了25 nm~10μm颗粒的稳定捕获, 这标志着光镊的诞生。接着, Ashkin等人利用光镊对病毒和细菌进行捕获, 这为光镊在生物领域的发展打下了基础。2018年诺贝尔物理学奖授予美国科学家阿瑟·阿什金（Ashkin），以表彰他在“光学镊子的发明及其在生物领域的应用”突破性贡献．光镊技术能方便地与其他多种光学技术衔接, 如在激光微束、荧光激发、共焦扫描显微镜、拉曼光谱仪等专有技术中集成。特别是光镊与高分辨率成像以及数字图像分析, 单分子荧光技术的结合，形成了一种强大的用于单分子研究的技术平台。

现在光镊已发展出众多分类，如传统光镊、全息光镊、等离子体光镊、波导光镊、光纤光镊等。每种方法都有各自的优势以及应用范围, 但是他们也存在各自的应用局限。

光镊可以在众多领域内应用，包括光镊与高空间分辨率技术的结合、光镊与光刀的结合、光镊与测量技术的结合、光镊与生命科学的结合等。随着光镊技术的进步和设备的更新普及，光镊将在更多科学研究中发光发热。

1. 1. 光镊原理

光镊，顾名思义，它的作用与镊子一样，可以固定并移动物体。但是与传统镊子不同，光镊不是依靠两点接触来移动物体，我认为其更像一个吸管，是依靠四面八方的力来操控物体。它利用高度聚焦的激光产生的光福射压使物体达到“钳”住的效果, 进而实现光束对微纳米粒子的迁移或翻转等操控功能。

我理解的光镊是依靠光子的动量来束缚并移动物体的，光是电磁波，它具有能量，同时光具有波粒二象性，光的粒子性为光带来了动量。光子撞击在物体上就会发生动量转换，光子会对物体产生一个力，让自己的动量转化为物体的动量。可以通过理论计算来求得粒子对于物体所带来的力。由于光电研究的微粒大小在十几微米到几微米的范围内，所以以透明电解质小球作为模型考察，通过光穿透小球的行为来分析光对于物体的作用力。

对于透明小球而言，反射光所产生的力远远小于透射光线产生的力，因此我们可以只考虑光的折射施加在小球上的力。以小球的圆心为原点（0，0，0），以光线的传播方向为z轴正方向。如图1.1所示，如果光沿z方向入射，光的动量是沿z方向的，离开球后光传播的方向发生了改变，光的动量就发生了改变，同时将动量传递给球。从图中我们可以，光在传播时沿x和y方向的横向力相互抵消，但仍然对小球有一个z方向的推力，这个力称为散射力。

图1.1 均匀光场与非均匀光场中的透明小球

如果光场是非均匀的，那么可以知道小球在非均匀光照作用下受到的合力不再指向z轴正方向，而是指向光场强的方向，即小球有向光场强的方向移动的趋势。这种由于非均匀光场所产生的、合力方向不朝z轴正向的力称为梯度力。

由于散射力和梯度力的存在，光会对小球产生一个约束作用，小球会被约束在光场最亮处附近。但是这个约束作用是有极限的，小球受约束是由于梯度力和散射力，而为了移动小球，一般而言，梯度力都是大于反射力的，合力将小球束缚在一个光阱中，称之为光阱力，即光阱力是由梯度力和反射力合成产生的。

光镊与小球的关系类似于弹簧，光阱力会随着小球距离光阱中心的距离增长而增大，但是如果一旦超过光镊的“弹性限度”，那么光阱力就不能够继续约束小球，小球将会逃离。如图1.2所示，光阱力和距离x的关系类似于胡克定律，但于弹簧的不同之处在于光阱力是三维力，它对小球的作用是四面八方的束缚，而弹簧的力仅为一维作用力。

图1.2  小球偏离光阱中心的位置x与光阱力的关系

对应于胡克定律y=kx ，光阱在某方向的光阱刚度相当于弹性系数k ，光镊相当于三维的弹簧，把ｘ和ｙ方向的光阱刚度统称作光阱的横向刚度，ｚ方向的光阱刚度称作轴向光阱刚度。光阱力和最大光阱力可以由流体力学法测量

1. 1. 传统光镊装置

    实验光捕获的光路由激光器、光学耦合器件、聚焦镜、照明光源和聚光镜、样品和样品室、样品台和操控器、成像与观测光学系统部分组成，如图1.3所示。 光学系统实现一个强度高梯度变化的光场, 能够对微粒进行捕获, 然后通过光与微粒所在的环境之间的相对运动, 达到操控微粒目的.

图1.3  光镊装置结构图

1. 1. 光镊分类
      1. 全息光镊

单个光镊难以实现对多个微粒的复杂操控。可以通过光学衍射的方法实现多个光阱的形成, 进而可对多个微粒进行操控, 该方法称作全息光镊。全息光镊利用计算机产生的全息图通过空间光调制器整合, 再经过激光束扩束、准直的处理后再次入射到空间光调制器中, 经过衍射调制成所需的光强分布, 最后通过望远镜系统就能得到一个光点阵列, 光点就是光阱，光阱阵列可同时对多个微粒的复杂系统进行操控。

1. 1. 1.  等离子体光镊

在金属导体和电介质的界面,由于金属表面的光与金属自由电子的相互作用, 自由电子与光波发生谐振从而产生等离激元。这种谐振能够将光场局限在金属纳米结构表面, 增加光场强度, 突破衍射极限, 从而实现对纳米颗粒的操控.

1. 1. 1.  波导光镊

光在光波导中传播时会在波导表面产生倏势场, 二氧化硅膜覆盖在氮化硅上制成氮化硅波导, 将激光从氮化硅波导平面射入, 将在波导面上产生倏势场。利用倏势场产生范围广、损伤性小的光力可对微粒进行操控。

1. 1. 1.  光纤光镊

光纤光镊是利用光纤头出射的聚焦光束作为光镊，目前已经由利用金属化纤探针产生的静电力、单根光纤、全内反射原理的光纤进行研究的成果。

1.5 光镊特点

１）光镊是以光场与物体交换动量的结果，光镊是“无形”镊子；操作是非接触的、无损的，没有机械镊子夹持物体有集中的受力点．

２）光的可穿透物体特性，穿过封闭系统的表层操控其内部微粒（细胞器），也可以透过透明的封闭的样品池外壁操控池内微粒，光镊能够实现真正的无菌操作．

３）光镊对物体的操控类似弹簧，在操作过程中能实时感应微小的负荷．光镊是极其灵敏的力传感器，力的分辨精度很高．

第二章  光镊在生物体内的研究

2.1 利用光镊进行手术的猜想与困难

我在微纳加工讲座中曾听过主讲人Mamoru Mitsushi教授的演讲，教授当时介绍了一种以硬脑膜缝合为目标的经鼻垂体手术系统，简单来说，该系统经鼻腔完成对脑手术后的缝合，是利用极微小的机械手深入鼻腔完成的。现代手术提倡微创手术，伤口的缩小有利于恢复，尤其是开颅手术，风险极大。不仅在手术中不能有丝毫偏差，在术后的恢复过程中也要服用抗生素，如果能够在不开颅的情况下进行手术，患者的痛苦和手术风险都会减少很多。经鼻垂体手术系统仍需要手术工具进入人体，不能做到真正意义上的无创手术，在了解到光镊去除小白鼠体内血栓后，我开始思考可否利用光镊穿透的能力来完成手术。

在我查找资料后，发现多年来光镊在生物方面的研究更多聚焦在单分子方面，例如细胞器的研究、DNA的研究等，少有在活体生物中的研究，在2013年，中国科学技术大学首次利用光镊直接操控活体小鼠耳朵毛细血管内的单细胞并实时跟踪观察单细胞的活动，他们提出了一套小球在血液中的力学模型，利用光镊成功做到直接控制动物活体内细胞。

但是光镊控制动物活体内细胞的研究进展非常缓慢。经过我的思考，光镊在活体动物内的研究困难的原因有以下几点：

第一，光镊依靠光来完成不接触控制，但是光的穿透力是有限的，超出一定限度后光阱将不能有效控制目标以至于完全失去控制效果。目前光镊只能在约100μm组织深度范围内捕获细胞，这一点极大的限制了光镊的应用，也决定了现阶段的研究都是在模式动物体内进行的。小白鼠、线虫和斑马鱼均是生物医学研究的重要模式动物，小白鼠的身体机能和人类有相近之处，故广泛应用于医药实验中，斑马鱼身体为透明形态，方便观察和光束的入射，尤其是斑马鱼的尾部，血液循环为单循环，易于操控。

图2.1  小白鼠与斑马鱼

第二，生物体内溶液环境复杂。光镊研究多在均匀稳定的介质中进行，纯水和盐水都可以实现操控小球。但是生物体血液成分是很复杂的，并且血液流速很快，想要使用光镊捕捉单个细胞的难度极高，如同在小轿车、货车、客车飞驰的高速公路上控制住单个车辆而不发生堵塞。因此光镊无法在动脉和较粗的血管中使用，只能在血液流速慢且细窄的毛细血管中展开研究。在流动血液中小球的受力情况与研究用溶液中完全不同，力学模型变得极为复杂，血流中细胞始终受到流场的剪切力，以及周围密集细胞的严重干扰，血液流速也会变化，这些变量为细胞控制检测带来更多挑战。

第三，光束进入血管需要穿越多层组织，如图2.2，不同层次的折射率不同，厚度也不同，光的入射情况不容易判断。实际操作时的光阱刚度和光阱的阱域不稳定，不利于标准化建模研究和光镊的控制。

图2.2  人体皮肤的层次

回到我开始时设想将光镊用于人体手术的猜想，我发现这个目标还是困难重重。如果光镊真正应用于手术，不仅上述问题将带来很大困扰，还会涌现出很多新问题。

1.光镊范围太小，操作时间过长。实际手术中仅仅操控数个细胞是远远不够的，病症不可能存在于单个细胞，而若依靠光镊进行大范围细胞操作，所需时间太过漫长，效率极低。小白鼠毛细血管去除血栓都需要花费数个小时，疗效过慢，无法真正意义上应用于临床医学。

2.难以观察。手术中必须实时观察手术情况，而正是因为光镊的精细操作，观察变得很困难。近几年复杂介质的波前矫正技术得到了优化，实现了深层介质内部的光学成像。但是，实现深度生物组织内的活体细胞成像技术仍无法直接应用于强散射的生物组织中。

3.光束带有能量，对单个细胞来说，光携带的能量是很大的。当光镊控制单细胞时，会不会对细胞产生未知的损伤，细胞中的转录、翻译过程会不会发生错误，这些问题都是有可能发生的。这些可能的情况会不会带来新的病症，是将光镊用于人体前必须考虑的问题。

总而言之，光镊的缺陷比优点更加突出。至少在现阶段，光镊完全不具有临床可操作性，还有诸多问题有待我们解决。虽然光镊在手术中有致命的效率问题，但是我认为它在一些特殊的场合可以应用。比如神经末梢的修复手术，神经病症一直是医学上的难题，至今仍有很多病症无法查明原因，医疗手段也十分有限，只能通过药物来刺激神经。如果光镊可以为神经方面的医疗带来突破，将会造福众多病人，为临床治疗带来巨大的突破。光镊技术在医学方面有很多困难，这是挑战也是机遇，如果能在技术发面有所突破，将其作为一种行之有效的治疗方法，无疑会为整个人类社会带来巨大的价值。光镊技术值得我们静心研究，我期待这方面的研究能够取得进展，使生物医学基础研究和临床应用更上一层楼。

2.2 光镊在活体细胞内操控的研究

光镊在活体细胞内的操控研究发展时间很短，但是已经有不少研究成果出现。这些研究针对细胞之间的相互作用机理、药物微粒（外来颗粒）对细胞的作用、细菌等外来生物对细胞的作用等多方面进行了研究，使研究者对细胞领域的生物机理有了更清晰的认知。这些收获可以为人体疾病的形成原因、药物的作用原理等一系列医学问题提供有力支持，研究意义重大。光镊深入到活体动物身体内对细胞进行操控和测量，是一个极具潜力的研究领域，我查阅了数篇论文，收获了很多有意义的知识。

2.2.1 活体微环境下细胞对细菌的行为

许多细胞机制依赖于生物结构之间的接触调节。一个突出例子就是血管，血管腔被一层内皮细胞包围，这些细胞在血管管腔和周围组织之间形成了一个重要的屏障，它有一些重要功能，如防止血液凝结、形成新血管和控制血压等。Johansen等[1]利用光镊控制鱼杆菌（一种可导致鱼类得肺结核病的细菌）在静脉血管中的位置诱导内皮组织外的吞噬细胞，观测吞噬细胞与鱼杆菌的作用过程，并开发了基于纳米颗粒的抗疾病疗法。

研究者详细观察了吞噬细胞对细菌的作用过程，光镊操控细菌与表皮细胞接触，观察靠近的巨噬细胞。巨噬细胞会靠近细菌并试图将其吞噬，进一步控制鱼杆菌移动，会发现巨噬细胞将跟随移动，最终可以被诱导到静脉血管中。

这种行为研究有助于对免疫系统的功能性考察，并且可以为人体自我调控机制的免疫治疗带来样本，对人体免疫失调病症如红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫病症的发病原因有更清晰的认识。此外，光镊可以用来确定一个细菌需要接触多久才能粘附在一个细胞上或引起反应，或者多个细菌是否会增加巨噬细胞的数量增多或影响吞噬动力学。

2.2.2 活体微环境下对药物微粒的操控

在活体脊椎动物模型中，斑马鱼幼体的光学透明度是独一无二的，也是其作为模型系统广受欢迎的主要原因之一。斑马鱼作为模型系统的一个最新应用是在纳米医学领域。

向斑马鱼幼体注入载药的纳米粒子，并在其表面修饰靶向因子，使其生物分布和血液循环能够通过实时成像进行监测。为了确定这些注入的微粒是否能被捕获在鱼的复杂环境中，Johansen等[1]将乳胶微粒注入2日龄的鱼幼虫。这些颗粒很容易分布在整个血液循环中，随着时间的推移，越来越多的纳米粒子要么粘附在血管内皮层上，要么被巨噬细胞吸收。

利用光镊进行研究，证实了光镊有较好的收集粒子能力，表明静态粘附在血管内皮层的粒子可以被捕获在斑马鱼体内，使得研究其他方法无法实现的相互作用细节成为可能。确定静态粘附粒子可以被捕获后，研究者又搭建多个光阱，证实了捕获被注入血流并高速流动的粒子是可能的，并成功地捕获并移动了直径为200nm至1μm的聚苯乙烯颗粒。

研究者还使用镊子移动与巨噬细胞相关的颗粒，以研究它们是粘附在巨噬细胞表面还是被细胞内化。使用三嗪来减缓血流，将一个微粒捕获并移走，导致其从巨噬细胞中分离，从而表明它不在巨噬细胞内。短暂关闭光镊不会导致粒子随血液流动，这表明该粒子通过纳米管与巨噬细胞保持连接。巨噬细胞在清除更大的物体中起着中心作用，了解这种相互作用对于基于纳米颗粒的纳米药物和药物的递送至关重要。

这些研究成果表明光镊在纳米医学领域也具备极大的潜力，可利用光镊控制药物粒子到达理想部位观察药效，也可以操作药物进行靶向性实验。

2.2.3 活体微环境下对细胞的操控

    钟敏成等［2］首次利用光镊直接操控活体小鼠耳朵毛细血管内的单细胞并实时跟踪观察单细胞的活动。他们利用光镊在毛细血管中控制了多个血红细胞聚集堵塞血管导致局部的“血栓”， 然后利用光镊主动对堵塞的血管疏通，使血流恢复正常.

 Johansen等[1]也进行了实验，他们在斑马鱼血管中尝试捕获红细胞，如图2.3，发现细胞可以在血流全速流动时稳定地保持在原位，甚至可以逆血流方向移动。并且发现斑马鱼红细胞的细胞核被捕获的最强烈，可以在稳定捕获的细胞核后面观察到“袋状”的膜，这种变形是由血液施加的阻力引起的，类似于细胞局部加热形成的气泡。这项实验表明，在斑马鱼体内，红细胞的光捕获能力很强，似乎比在小鼠耳中实现的更为强大。在小鼠耳中，捕获必须在利用关键血管壁逐渐完成。这可能是因为小鼠的红细胞缺乏细胞核导致其不便捕获。

图2.3 在斑马鱼血管中控制红细胞

      光镊系统可以研究细胞相互作用的动力学，与细胞的特定区域接触，还可以用来研究粒子以受控方式被推到巨噬细胞上时与之相互作用的接触力的作用。

2.2.4对脊椎动物耳石的操控

    在脊椎动物中，前庭感觉器官包括耳石，耳石的运动触发毛细胞的活动来检测加速度，以及半规管，半规管对旋转刺激敏感。斑马鱼幼虫的半规管还没有功能，只有椭圆囊耳石检测前庭刺激。因此，椭圆囊耳石和它们所刺激的神经细胞代表了一个起点，所有前庭处理必须从这个起点开始。这意味着获得对椭圆囊耳石的物理控制将能够探索前庭系统，并允许对前庭发出刺激进行独立的双侧控制。

    由于耳石不是完美的球形晶体，需要建立与其对应的力学模型，Favre-Bulle[4]等使用扫描一束聚焦光束穿过手术切除的椭圆耳石，并测量散射光的平均偏转，从而确定了该数学模型，发现发现1064nm聚焦激光束可以在250 mW或更高功率下拖动自由耳石。

图2.4 斑马鱼幼体中椭圆囊耳石的位置（比例尺，200微米）

     研究者进行了一系列实验，利用光镊对活体斑马鱼耳石施力的方法来模拟前庭刺激，探究耳石的不同刺激对斑马鱼带来的影响，发现了耳石上的内侧和外侧力导致互补的矫正性尾部运动，两侧耳石上的侧向力足以引起双眼的滚动矫正，并详细研究了前庭刺激与斑马鱼鱼尾摆动角度的关系，为前庭处理的功能定位奠定了基础。

虽然生物组织面临光散射和功率损耗的挑战，但该研究仍然能够在标准显微镜组件和中等功率的激光下有效地使用，证实了光镊捕获具备足够强大和精确，可以在体内移动大型物体。

如果光镊技术能更进一步解决一些技术难关，我们完全可以利用光镊研究生物体内结构的功能实现，进一步认识生物完成调控的方法。

2.3 总结和畅想

光镊在活体生物内研究的许多方面已经得到以往技术所不能达到的成果，但是我也承认光镊技术在一些更进一步的研究中存在着诸多困难，就如我所猜想的把光镊利用在人体的手术中，以目前的技术手段来看，这个想法完全不具备可实现性。但是这并不能全盘否认光镊，光镊的优势还是非常突出的。

尤其是在活体生物中，在不影响组织结构功能的情况下，可以利用光镊的穿透性对相应部分进行研究。这与其他技术手段从整体中剥离部分进行独立研究具有本质性不同，光镊有能力在不影响整体功能的情况下，在大环境中研究某一个具体结构，这种研究可以更为精确与科学的探究结构的功能。在体外观察并操控一个细胞所能得到的知识是有限的，但是如果将这个细胞放在生物体当中，它就有了无限的可能。我们可以研究这个细胞与其他细胞相互关系，研究这个细胞在不同组织中能够发挥的作用，简单的说，当细胞处于生物体中，我们所研究的点就不再仅仅局限于单个细胞、单个组织，而是在研究整体中各个结构的相互关系的，这种研究结果就更加具有整体性。因为它是在一个正常工作的系统中完成的，正如对斑马鱼中巨噬细胞的研究一样，如果我们单独研究巨噬细胞，那么是不可能得到相应成果的。

光镊甚至还可以模拟生物体内一些信号的产生，利用光镊模拟斑马鱼耳石信号的产生，得到了一些非常有趣的结论。这个实验不仅研究了耳石的作用，还研究到前庭眼睛反射的现象。同时也确认了有两类神经元能够将信号从椭圆脑膜细胞传递到网状脊髓神经元中，激活尾部的同侧偏转，从而使斑马鱼向前游动。这些研究与刺激青蛙已完成协调反射的意义完全不同，光镊研究所带来的系统性是其他技术手段无法比拟的优势。

由于光镊功率、不同组织的折射率等一系列问题，现在的光镊技术对活体生物的研究还有很大的局限性，甚至于它在对人体手术等方面的应用可能几乎为零，但是我们也必须承认，光镊技术在某些方面具有得天独厚的优势。这些优点是与光镊的创新性和前瞻性息息相关的，正是因为光镊技术的巨大应用市场和广阔的发展空间，才吸引着更多的研究者去探索和改进光镊。如果这些技术研发有一些突破，那么束缚光镊研究的瓶颈也就随之消失，光镊能够在更多的应用领域发挥自己的创造力。

第三章  光镊对生物大分子的研究

3.1 光镊对蛋白质的研究

光镊在单分子生物学的一个重要应用是研究蛋白质折叠的动力学过程。氨基酸组成肽链，肽链以一定的空间结构保证其功能并形成蛋白质，蛋白质的三维结构对其功能至关重要，同时也和一些疾病的形成有着密切的关系。尽管人们已经利用各种传统的生物化学方法对蛋白质的折叠过程进行了长期研究, 但对过程中的具体动力学细节仍不甚明确，光镊技术可以对操控单个蛋白分子并实施观测三维结构形成的动力学过程，还可以利用光镊搭建具有特定空间结构的蛋白质，所以在研究生物物理的精细过程中具有广阔的应用空间。

Gao等[6]利用光镊技术对突触SNARE蛋白的组装机制进行了深入研究。研究者通过实时观测单个SNARE复合体的组装与去组装过程，发现SNARE复合体的“拉链式”结构和关键的“半拉链式”装配中间体，提出了一种高效率的“拉链式”组装模型，并证实这种分步组装的过程是SNARE复合体的普遍特性。即该蛋白分子不是一下组装完成的，而是首先缓慢组装，在中间体充当调节平台的调节模式下，进行快速“拉链式”组装，最终在跨膜区驱动膜融合。

Huang 等[7]利用光镊研究了Vinculin与肌动蛋白纤维相互作用的力学解离特性，发现在8皮牛外力的作用下， Vinculin与肌动蛋白纤维两端的结合时间相差10倍，首次提出了分子力作用方向依赖的不对称性“逆锁键”的概念。

3.2 光镊对DNA的研究

   遗传信息可由DNA流向DNA, 完成DNA的自我复制过程; 也可由DNA流向RNA再进一步流向蛋白质, 完成转录翻译过程。这是构成现代生物学的理论基石, 因此, DNA、RNA与蛋白质的特性以及它们之间的相互作用无疑是整个生物学研究的核心。

    研究者利用单分子光镊技术操纵长约16μm的ds DNA分子, 测量了DNA的拉伸特性，通过研究蛋白质对DNA拉伸特性的改变来研究DNA相关蛋白(如RNA聚合酶、核糖体、 DNA异位酶等)的工作机制。还有研究者利用光镊技术将参与高级染色体结构形成的凝聚蛋白Mu KBEF作为研究对象，解析了细胞分裂时,DNA发生凝缩形成高度聚集结构的过程。

简而言之，光镊在操控小分子完成大分子组装和大分子相互作用方面的优势巨大，光镊可以在不损伤外部结构的情况下可以对内部结构进行控制和观察。这对DNA的研究是十分有利的，甚至可以在转录、翻译过程中对DNA\RNA分子进行操控，来进行各种不同的研究。此外，光镊对力十分敏感，可以利用光镊测定生物大分子之间结合强度，对生物大分子相互间作用力的定量测量和分析做出重要贡献。

3.3 光镊与其他技术的结合

光镊已经在分子生物学研究上做出了突出贡献，它的应用极大地推动了生命科学尤其是生物物理学的发展, 加速了人们从单分子水平解析DNA、蛋白质以及各种酶反应的动力学过程，但是相比复杂多变的生物体，这些研究还远远不够，仅仅是冰山一角。为达到更好的研究水平，光镊也常常与其他技术相结合，优势互补，完成性能更优的实验任务。

3.3.1光镊与sm FRET技术结合

    sm FRET技术全称单分子荧光共振能量转移技术 (single molecule fuorescence resonance energy transfer, smFRET)，是为了揭示核小体的结构动力学所研发的装置。在smFRET技术出现之前，分子生物学研究往往只检测特定时间内的大量分子的平均行为，缺乏检测单个分子的行为。smFRET技术的原理就是将2个相互作用的分子标记上颜色不同的荧光基团，一个是在能量转移过程中提供能量，即供体;另一个接受能量，即受体。这样可以运用荧光共振能量转移技术来对体系进行研究。因此，比单个荧光基团标记更具有优势，称为单分子荧光共振能量转移技术。

图3.1 sm FRET技术

    smFRET技术在研究核小体的结构动力学方面发挥了重要的作用。当单个荧光基团标记到目标分子后，它能在多方面去探测目标分子。由于其能在单个分子内或分子复合物中，以纳米级别，实时追踪变化，因此可用于解答许多重要的生物学问题。此外，smFRET技术在DNA和组蛋白相互作用研究中的应用帮助研究者发现核小体重塑因子可以使染色质保持动态，使得DNA在适当的时候局部释放出来。

生物大分子一般都具有空间结构，比如蛋白质就是三维结构，但是光镊只能够在光阱的方向，即在一维空间中研究大分子的动力学。如果使用多光镊，可以做到在二维空间内移动大分子，但是这仍远远不够，依旧无法获得大分子的具体构象变化过程。而单分子荧光共振能量转移检测技术可以实时的观测分子构象的变化过程，但是它的空间分辨率不够高，难以获得清晰准确的判断。我们将光镊与smFRET技术相结合，就可以在亚纳米级的尺度下更好的检测生物分子的变化。现在已经有研究者将这两种技术相结合，并对DNA和其互补序列的杂交过程进行了研究。

3.3.2 光镊与拉曼光谱技术结合

拉曼光谱分析法是基于印度科学家C.V.拉曼（Raman）所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。

图3.2 拉曼光谱与红外光谱的对比

拉曼光谱一次可以同时覆盖50-4000波数的区间，可对有机物及无机物进行分析，谱峰清晰尖锐，更适合定量研究、数据库搜索、以及运用差异分析进行定性研究。常规拉曼光谱只需要少量的样品就可以得到。这是拉曼光谱相对常规红外光谱一个很大的优势。此外，拉曼光谱对溶液的要求同光镊基本一致，与光镊有很好的适应性。同时拉曼光谱探测技术通常使用化学修饰将研究对象固定在机制上, 这种配置非常不利于生物分子维持其天然的生理状态, 结合光镊技术的激光光镊拉曼光谱系统则可以利用激光形成的光阱捕获生物分子，实现在溶液中将其固定并同时得到光谱信号的目的, 保证了生物分子天然的微环境，极大的降低了噪声的影响。

目前光镊与拉曼光谱结合进行的研究成果已初具规模，比如采用光镊悬浮技术捕获颗粒尺寸3～8μm的丁二酸钠/硫酸铵混合气溶胶液滴，利用非弹性米氏散射理论计算实时液滴半径尺寸。在生物研究方面，研究者利用激光光镊-拉曼光谱控制单个大肠杆菌细胞，研究其对抗菌药物的敏感性，取得了不错的实验结果。激光光镊拉曼技术无需样品预处理，对样品无损害，是临床研究一个很好的切入点，尤其在活体生物细胞研究领域，两种技术的结合会带来更多的突破。

3.4 总结

在生命科学研究领域，光镊已经成为一个不可替代的工具，它对微观粒子的控制和观测作用是非常优秀的。我们去实验室参观室时，看到了实验室对生物大分子进行操控的光镊系统。我们参观了实验室自己搭建的光镊系统和购买的光镊研究设备，并且操作了光镊研究设备。该设备给我最大的印象就是便捷，因为它是一个成品设备，不需要我们在工作时一点一点调整光路，依靠一个手柄就可以很简单的做到利用光镊操控微粒，并且会有传感器来实时感知光镊受到的力。我们可以从电脑上来观测光镊运行时的各个参数，从而可以做到对所要研究分子的操作。整套系统的操作难度是比较低的，只需要做到对数据的采集分析和光镊的控制，就可以很好的完成实验。这对光镊的普及化研究和发展是非常有利的。

除此之外，光镊的系统设计中还有很多精妙的地方。就比如观察样品是被分区的，可以利用光镊在各个区域中选择所要观察的目标，并移到一个没有其他微粒存在的区域展开实验。

我觉得如果光镊的价格能够有所下降，那么它很有可能和显微镜一样成为生物研究方面的大众化仪器。虽然光镊在对生物大分子的研究方面具备很多的优势，但是知名度不是很高，我是在2018年诺贝尔奖颁布之后，才第一次听到光镊这个词。

这提醒我，很多技术不是不存在，而是我们不了解。一些问题可以利用新技术简单的解决，但是因为知识面的不足，可能还会使用老方法老技术去研究问题。这就可能导致我们在科学研究方面处处拉人一步，就是同MATLAB一样。我的老师讲述在他上学的时候，学校里的机房是需要排队使用的，很多问题都需要自己去编程来完成，非常的不方便。而当时国外已经出现了Matlab的上市版本，但是他们并不知道，这就导致做了很多的工作，但是效率很低。所以我觉得我们不仅要做技术的研发者，还要时刻关注新技术的诞生，这会帮助我们少走很多弯路。一些以前做不到的实验，在新技术的帮助下就可能变得轻而易举。这同样督促我们不断的丰富完善自己的知识面，只有拥有更广阔的视野，才能敏锐的察觉到新技术所带来的科研革命和科技热点。

第四章  其他单分子力谱检测系统

4.1 原子力显微镜

   原子力显微镜（Atomic Force Microscope ，AFM），是一种可用来研究包括绝缘体在内的固体材料表面结构的分析仪器。它通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。将一对微弱力极端敏感的微悬臂一端固定，另一端的微小针尖接近样品，这时它将与其相互作用，作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。扫描样品时，利用传感器检测这些变化，就可获得作用力分布信息，从而以纳米级分辨率获得表面形貌结构信息及表面粗糙度信息。

    原子力显微镜的扫描方式，包括上扫描、下扫描和组合扫描，上扫描是探针移动样品不同，下扫描是探针不动样品移动，而组合扫描是指探针与样品同时移动。探针一般是悬臂梁形态，探针的加工主要利用半导体不同晶面的腐蚀速度不同，可以将半导体材料加工成一个倒旋的金字塔，或者可以使用聚焦离子束将材料缓慢剔除。

AFM在十几年前就被应用于在单分子水平研究蛋白质动态相互作用的研究中，单分子力谱的应用中, AFM的采样频率可以达到1 k Hz以上, 悬臂梁的刚度范围约为1~105p N/nm, 空间分辨率一般为0.1~1 nm, 力的测量范围一般是1 0~103p N。因其测力范围较大, 应用范围很广, 可以胜任检测单个共价键/非共价键的断裂, 也可以应用于单个蛋白质分子的解折叠等研究。AFM还被广泛应用于生物大分子的动态检用中, 其广泛的应用性也促使方法本身得到迅速的发展。T字型设计的悬臂梁具有更高的共振频率, 可以将AFM的时间分辨率提升至5微秒左右, 也因此可以发现蛋白质分子时程更短的中间态。但是, AFM悬臂梁刚度较大, 所以无法准确测量10pN以下的较小的生物力, 对很多弱的蛋白质相互作用的研究存在一定的局限性。而且AFM仅能检测胞外的膜蛋白质，对细胞内蛋白质要使用提纯的样本进行体外实验。

4.2 磁镊

磁镊通过磁场控制超顺磁性小珠的移动，并利用这个小珠捕捉单分子，从而进行接下来一系列力学拉伸的实验。磁镊用永磁体或电磁体吸引磁珠，连结于磁珠与基底间的生物分子受到磁珠传递的作用力；使用倒置显微镜观测磁珠位置,以表征分子长度变化。磁镊很好地避免了热与光对样品生物活性的损伤，对样品的要求低于光镊，对系统漂移与噪声也不敏感。磁镊作用力可达nN量级或更大，但是其空间分辨率仅为nm量级，这在一定程度上制约了磁镊在某些研究中的应用。

此外，磁镊采样频率一般为60~200Hz。这使得磁镊在解析DNA/RNA螺旋、蛋白质间相互作用、单个蛋白质结构力学特性的实验中具有较大优势。和AFM相比, 磁镊能精细测量100 pN以下的机械力学, 更加接近生命体中分子水平机械力的工作范围。美国哥伦比亚大学利用磁镊对Talin蛋白反复拉伸与释放时, Talin上与其他蛋白的结合位点不断暴露隐藏，两者不断结合和解离，通过荧光显微镜检测荧光强度变化, 可以得到Talin蛋白在结构折叠和解折叠时构象变化的规律和发生反应的力学反应。

光镊和磁镊在很多特性上是类似的，都可以实现穿透的功能，他们有能力在不损伤细胞整体性的情况下，操纵细胞内部的结果。此外光镊和磁镊对力的敏感程度都很高，这使得他们在分子动力学研究方面有很强的优势。虽然磁镊相较光镊的测量噪声影响较小，但是传统磁镊只能在单个方向上施加机械力，对研究空间结构物体的物理特性有较大的限制。不过随着技术的不断发展，荷兰戴尔福特理工大学，研发出了能够提供转矩和扭矩的磁镊，在大分子三维结构研究方面有很大的帮助。与光镊类似，磁镊也可以与拉曼光谱与FRET技术结合使用，可以达到更好的实验效果。

4.3 生物膜力学探针

生物膜力学探针( biomembrane force probe，BFP) 以红细胞作为力学传感器，通过光学检测红细胞的形变，实时观测作用在分子上力的大小。在其测力范围内，红细胞可以近似看作服从胡克定律的线性弹簧。生物膜力学探针的刚度一般是0.1～3pN/nm，采样频率可达1～2kHz，空间分辨率可达2～3nm，测力范围一般在1～103pN。

与原子力显微镜类似，生物膜力学探针采用接触式的测量方法，尤其适用于细胞表面膜蛋白及其配体动态相互作用的原位检测。而对于胞内的蛋白质相互作用测量有所欠缺。生物膜探针结合了光镊与原子力显微镜的优点，测力的灵敏度很高，而且测力的检测范围广，与其他技术配合可以进行多方面的研究。

第五章  课程收获与建议

我上这门课最大的收获是了解到很多单分子方面的技术手段，比如光镊，扫描隧道显微镜，原子力显微镜等。此外还学习了对单分子的检测手段，比如对影像采集的CCD模块是如何工作的。我觉得重要的并不是这些知识，而是让我们建立起对单分子技术一个更宏观的观念。了解知识固然重要，但是我们无法从旧的知识中领悟到新的知识。除非我们带有一种更宏观更高屋建瓴的思想观念去看待问题，对旧的知识进行思考，这才有可能诞生出新的闪光点。所以我们不应该拘泥于一些知识的了解，更要注重对整个技术的宏观理解。在学习了这门课之后，一定要明白为什么要学习单分子技术，单分子技术的优势在哪里，我们如何利用这些技术去实现我们的想法，这些更进一步的思考要比单纯的掌握这部分知识更重要。所以我们不应该因为学习到知识就感到满足，停步不前，需要在掌握知识的基础上去思考问题，从而产生属于自己的理解。

为什么要学习单分子，我认为这是一种大趋势。现在的技术有两个主要的发展方向，第一个是朝更宏观的方向发展，比如航天飞机等大型机械。另一方面就是朝更微小的方面研究，就如制造行业现在更多的追求微纳加工制造，因为加工制造出的零件表面质量高，能让总体机械的性能更进一步。这两个方面是现在技术发展的主要趋势，单分子技术毫无疑问的属于微纳技术方面，对这方面技术的研究能够带来宏观无法观测到的实验现象，同时利用这些技术，也能够生产出普通手段无法生产的特殊用途工具和具有更高精度的整体机械。这充分说明对单分子技术的钻研，不仅能够带来科研收益，还能够带来经济收益，它能对我们的生活产生非常大的改变，让一些以前无法制造或制造有困难的产品，能够更简单更廉价的生产出来。此外，单分子技术还可以拥有更高的测量精度和更好的操作效果，这对我们进行研究是非常有帮助的。

我对光镊的一些特性非常感兴趣，尤其是，光镊的穿透特性，我觉得它是进行无创手术一个非常好的手段，所以我进行了这方面的调研。在这个过程中发现不单单是光镊可以做到无创，还有磁镊和声镊，这些技术都有潜力进行无创手术。虽然这些技术各有各的特点，而且已经被广泛地应用于科研领域，但是都不能做到无创手术。我发现我的研究方向可能出了一些问题，因为单分子技术更多的是针对分子量级的单个微粒进行研究，它们在科研领域有很强的应用，但是它们的研究目的决定了它们不能被适用于手术。这些问题是我之前没有预料到的，也给了我一些教训，想事情不能理所当然的想，要根据实际情况出发，要深入的了解事物的客观规律，在此基础上做出判断。

虽然利用单分子技术完成手术的猜想不成功，但是我还是学习到了很多有关单分子技术的应用，尤其是光镊技术的应用。经过我的学习，在生物大分子的研究方面，我认为可以包括三个大类。第1类是类似于光镊技术和磁镊技术的非接触控制操作技术。他们的特点是不会直接与被测量或操控的物体相接触，而是利用光或者是磁场来间接的达到控制的目的。第2类是类似于原子力显微镜的接触式测量方法。他要求必须与被测物体相接触，才能得到准确的测量效果。最后一类是单分子荧光共振能量转移技术，这类技术是间接的通过其他物体来反映被测物体的规律，用一些特定的标记来达到测量的效果。这些单分子技术手段各有千秋，可以单独使用，也可以配合使用，在进行实际研究时，需根据研究对象的特点来选择相应的合适的技术。

我对单分子课程有一些建议。第1点是希望能在课程讲解中加入一些视频的环节，因为视频能够更清晰的说明测量仪器的工作原理和工作情况，相比图片有更好的教学效果。第二点时希望老师在讲解时能够说明一下安排课程的思路。因为老师毕竟知识丰富，安排课程肯定有自己的思路和想法，是希望我们从中获得某种能力。所以希望老师能把整个课程的思路线挑明，这样会有提纲挈领的效果。衷心的希望单分子课程能够越来越好，为更多的同学了解单分子技术提供一个契机和平台。

最后，分子世界有很多的奥妙有待人们去探究，单分子技术为我们提供了一个平台来完成我们的猜想。虽然现阶段单分子技术仍然有一些缺陷，但是随着人们的不断研究，我相信会有更加完善，更加成熟的单分子控制测量技术问世，来帮助我们更好的认知分子世界。