光学显微镜分辨率极限

概述

按照几何光学定律，只要适当地选择透镜的焦距，就可以造出极高放大倍数的光学系统，将任何微小的物体放大到清晰可见的程度。但实际上做不到。光具有波粒二象性，按照波动光学，光学显微镜放大倍率受可见光波长的限制，即便使用超高倍率，在显微镜下看的无非是模糊的像，没有意义。19世纪末，德国物理学家恩斯特·阿贝指出，光学显微镜受限于光的衍射效应，存在分辨率极限（也称阿贝极限），其数值大约是可见光波长的一半。而可见光的波长范围如下图所示，波长最短的为蓝紫光，约400nm，因此光学显微镜最小分辨率极限为200nm。当两个点距离小于200nm，光学显微镜无法分辨。

分辨率极限原理

显微镜使用的是凸透镜，按照经典几何光学理论，凸透镜能将入射光聚焦到它的焦点上，但由于透镜口径有一定大小，光线透过时会由于波动特性会发生衍射，无法将光线聚成无限小的焦点上，而只会形成一定能量分布的光斑。中央是明亮的圆斑，周围有一组较弱的明暗相间的同心环状条纹，把其中以第一暗环为界限的中央亮斑称为艾里斑（airy disk）。
每一个发光的物点，经过有限直径的透镜后，都会在像平面形成一个艾里斑。对于非常接近的两个点，成像后艾里斑会过于接近，以至于无法分辨。若两个等光强的非相干点像之间的间隔等于艾里斑的半径，即一个艾里斑中心与另一个艾里斑边缘正好重合时，这两个物点刚好能被人眼或光学仪器所分辨，这个判据叫做瑞利判据（Rayleigh Criterion）。
在这里插入图片描述满足瑞利判据的两个艾里斑中心的角间距，或者两发光物点对透镜光心得张角叫做最小分辨角
$\varphi=\frac{1.22\lambda}{D}$
其中 $λ$ 为波长， $D$ 为通光孔的直径。从公式可以看出，当光的波长无限减小或者通光孔的直径无限增大，光的波动性就逐渐减弱，这就回到经典几何光学的结论，理想光学系统分辨率是无穷小的。当然，这两种情况在现实中都是不存在的，所以理想光学系统一定会受到波动性的影响，存在分辨率极限。
在这里插入图片描述由于显微镜放大倍率较大，物距 $L$ 接近于焦距 $f$ ，显微镜分辨率用物点可分辨的距离表示
$\sigma = \varphi L=\varphi f=\frac{1.22\lambda f}{D}$
以 $\frac{D}{2f} \approx sin\alpha$ 带入上式（ $α$ 是孔径角的一半），并考虑到物镜空间折射率 $n$ 影响，得到阿贝方程（Abbe’s equation）
$\sigma = \frac{1.22\lambda}{2nsin\alpha}=\frac{0.61\lambda}{NA}$
其中 $N A$ 表示数值孔径， $NA=nsin\alpha$ ，数值孔径越大，分辨率越高。
亥姆霍兹和阿贝针对不发光的点（即被照明的点）研究后，给出相应的分辨率公式：
$\sigma=\frac{\lambda}{NA}$
在斜射光照明时，分辨率的公式为
$\sigma=\frac{0.5\lambda}{NA}$
当显微镜物方介质为空气时，折射率 $n = 1$ ，物镜最大的数值孔径为1

显微镜分辨提升

病毒、生物大分子的尺度都小于200纳米，光学显微镜没法看到它们。要突破光学显微镜的极限，就要使用比可见光波长还短的波来观测，例如紫外线、X射线，还有电子束。没错，电子束也能形成波，只不过波长极短，这使得电子显微镜的分辨率能够达到0.2纳米，放大上百万倍。
但是在目前的科研中，光学显微技术仍旧是不能取代的。电子显微镜的工作原理是把可见光换成了电子束，相当于是降低了Abbe方程中的波长这一项，从而取得了更高的分辨率。但是电子显微镜存在它本身的问题：操作复杂、设备昂贵且笨重、制备观察样本麻烦、不能观察活样本。这些问题导致电子显微镜在很多科研领域不能完全替代光学显微镜。