各位老师们好，初来乍到。请版主手下留情，发文不易，本文更多的是关于巨噬细胞的心得分享，初衷只是希望做相关课题的老师能够规避一些问题。也希望能帮到一些老师发高分的SCI 文章。
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本文历时两年的实验经验总结。在此，我们不去讨论实验原理与否以及造模方式。很多文献都有参考了。咱们上图给数据，欢迎大家指点，有不对的地方大家多多包涵。
关于巨噬细胞的热度，在此我就不多说了。鉴于其较高的实验门槛，还是很受到国自然项目的支持。当然有些老师，科研能力非常强，那也欢迎提供更好的建议。除了细胞实验外，也会说一些关于动物实验染色的部分。本文的意义在于，借此希望能够帮到一些没有时间做实验的老师，如果有什么不符合逻辑的地方，老师们可以私聊我修正文章。
巨噬细胞标记物
巨噬细胞的标记物包括CD68,CD80,CD163等等，当巨噬细胞出现极化时，M2亚型的细胞的标记物就变成了CD163,所以，可以通过免疫荧光双染的方法或者流式来确定M2亚型细胞的表达。即（CD68 +CD163）,or （CD68+CD206）
M1:CD68,CD86,CD282,CD284,iNOS
M2:CD163,CD206,CD200R
下文开始我们的重点。流式表面抗原，形态以及病理染色。
巨噬细胞极化的方法哪种最好我们在次也不去做评判，不管是IL-4细胞因子刺激细胞的极化，还是LPS模型诱导，总有人做得好，也有人做不出来。在此，我们不讨论方法了。希望平常心去对待任何一个实验。套用最近很火的段子，实验结果不说钱，说缘，SCI 就是每个医学生最大的怨念。
流式表面抗原
thp-1用pma诱导方案相当成熟了，pma诱导成m0之后，然后你通过改变生长因子，来调节他的一个比例。
流式双标表面抗原
实验过程中，我们发现了一些问题。虽然细胞形态已经发生了改变，但是我们通过初次的染色，结果发现了细胞形态惊奇了复原了。目前，我们也无法得知是什么原因，技术员的猜测是可能是细胞爬片在固定之后，放在PBS里面泡久了， 而且实验过程中也是需要过夜，建议大家使用温和的多聚甲醛或者电镜固定液去固定细胞，然后缩短实验流程，加速完成染色的步骤。如果你们没有出现类似的这样的情况，那么恭喜你，直接正常做染色了。目前细胞的IF 单标，或者双标的话，还没有出现很大的技术难度点。
形态以及病理染色
如图，FITC 标记巨噬细胞M1,594 标记M2. 目前我们遇到的最大的困难就是在于动物组织蜡块染色的部分了。关于巨噬细胞的动物模型，目前在急性的疾病模型中能得到一个不错的阳性率，但如果是慢性模型，很有可能巨噬细胞已经转化成其他细胞了。例如，我们通过不断的实验摸索中发现，心梗7天的大鼠心肌巨噬细胞的阳性率远高于心梗1个月的大鼠心肌。一个模型的成功与否，往往才是决定这个实验结果最重要的一个环节。实验也只是一种概率，几乎没有任何研究课题会完全按照预期发展。如果有，这种研究不会有任何突破、不会给人带来任何惊喜。
真实实验都是探索性的，不要认定任何实验都是 must be.
造模成功之后，我们再继续深挖染色部分的难点。
众所周知，Rabbit Monoclonal Antibody 的特异性是非常好的，广泛应用于各种实验，WB,IHC,IF,IP 等等。因此对于CD68或者CD206来说，我们无脑冲一支TOP级别的厂家抗体就行，千万别手软。而对于另一个标记物的抗体选择就没有那么多了，特别是很多老师实验动物的种属是犬或者兔子，猪，本身就没有对应的特异性抗体。即使是实验种属是鼠，鼠来源的抗体做染色，也必定会产生很多非特异性染色。
因此，我们实验初期更换了很多不同厂家的抗体，不同的种属，不同的器官，但是都没有得到一个特异性很好的图片数据。
心肌细胞双标
肾CD68
非特异性染色，相信也是很多老师遇到的问题。而且，我们也比对过很多阳性对照组织染色，单染没有问题，不管是CD68,还是CD206，或者是iNOS,只要是做双标，那么特异性就非常差，无法分辨出单个细胞。就这样，我们还是倒在了巨噬细胞的脚下。
脾CD68阳性对照
失败的经验让我们也总结出了一些问题，那就是双染抗体的种属来源的确还是应该尊重其本身的应用，同种属不能做双标，鼠抗鼠也很难得到好结果。虽然大部分的结果都说不上差强人意，估计也是很难达到文章的要求。但是我们在巨噬细胞攻克的道路上从未止步。直到近几年TSA技术的出现，我们也是潜心摸索过河，研发自己的成熟的试剂盒，优化实验技术。终于取得成功。
TSA，Tyramide signal amplification 技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。该技术可与高性能染料Alexa Fluor®、传统荧光染料和比色检测系统相兼容。通过使用TSA技术可以检测到传统方法无法检出的低丰度靶标。基于酪酰胺的信号放大技术能够在无需牺牲分辨率的条件下提供前所未有的敏感度。
下面我们就来欣赏下巨噬细胞M1,M2的美图。
目前，我们的大量样本结果总结出来，人肿瘤样本特异性非常好，巨噬细胞染色双标成功概率非常大。而且，我们通过不断的更换TOP级别厂家同目的蛋白，不同货号的抗体，也筛选出了一些非常适用IF和IHC 的巨噬细胞抗体，之前的样本都得到了明显的改善。
如果是做鼠的巨噬细胞双标，或者犬的，我们依然还是选择优化造模方案，以及更换合适的抗体，毕竟TSA也不是100% 能完成巨噬细胞双标染色。同时，我们也依然再探索巨噬细胞三标染色。再次重申，造模，造模，造模很重要！！！
人肿瘤CD68+CD206
犬心肌CD68+iNOS
肾CD68实验后
以上，是这几年的一些心得，和遇到的一些问题，真诚的和大家去分享。希望能够帮到一些老师们。码字不易，如果认可，辛苦点赞。
