来源于延胡索的的亚甲二氧桥CYP450-文献精读120

Structure-function analysis of CYP719As involved in methylenedioxy bridge-formation in the biosynthesis of benzylisoquinoline alkaloids and its de novo production

CYP719As 在苯基异喹啉生物碱合成中涉及亚甲二氧桥形成的结构-功能分析及其从头合成

摘要

苯基异喹啉生物碱（Benzylisoquinoline Alkaloids，BIAs）是一类具有临床应用价值的次生代谢产物。(S)-Stylopine 是一种特殊的 BIA，其分子中含有亚甲二氧桥结构。CYP719A 酶可催化原小檗碱类生物碱 A 环或 D 环上的亚甲二氧桥形成，并表现出显著的底物区域特异性。为了探究 CYP719A 的底物偏好性，我们从延胡索 (Corydalis yanhusuo) 中克隆并鉴定了五个 CyCYP719A 候选基因。经研究，发现其中的 CyCYP719A39 和 CyCYP719A42 在 D 环或 A 环上的亚甲二氧桥形成方面具有较高的催化效率。通过同源建模和突变分析，鉴定出 CyCYP719A42 中的 Leu 294 和 CyCYP719A39 中的 Asp 289 为调控 CYP719A 区域选择性的关键残基，它们影响 A 环或 D 环上的亚甲二氧桥形成。

此外，为了实现 BIA 的从头合成，我们将 CyCYP719A39、CyCYP719A42 及其突变体引入 (S)-斯可鲁林（(S)-scoulerine）生产酵母菌株中，成功实现了 32 mg/L 的 (S)-Stylopine 产量。这些研究结果为理解 CYP719A 介导的亚甲二氧桥形成的结构-功能关系提供了基础，同时为通过合成生物学手段生产 BIA 提供了酵母菌株。

具有亚甲二氧桥的苯基异喹啉生物碱的生物合成途径

结果

CyCYP719A 的鉴定和系统进化分析

在延胡索 (Corydalis yanhusuo) 的转录组中发现了五个被注释为“CYP719 家族”的全长基因 [25]。这些基因从延胡索中克隆出来，并根据 CYP450 命名委员会的指南命名为 CyCYP719A38、CyCYP719A39、CyCYP719A40、CyCYP719A41 和 CyCYP719A42（序列见附加文件 1：材料 S1）。

多序列比对分析显示，这些基因具有典型的真核细胞细胞色素 P450 的保守区域，包括螺旋 K 区、芳香族区域和 C 端的血红素结合区 [20]（附加文件 1：图 S1）。CYP450 的 I 螺旋中存在保守的氨基酸序列 [(A/G)GX(D/E)T(T/S)] [26]。然而，在 CYP719 家族中，亮氨酸（Leucine）替代了保守的丙氨酸（Alanine）或甘氨酸（Glycine），丝氨酸（Serine）替代了保守的苏氨酸（Threonine）（附加文件 1：图 S1）[27, 28]。

已知 CYP81Qs 和 CYP719As 亚家族基因能够催化亚甲二氧桥的形成 [21, 29]。在本研究中，对参与亚甲二氧桥形成的 CYP450（包括 CYP81Qs 和 CYP719As）以及参与 BIA 生物合成的功能基因（如 CYP80s、CYP82s 和 CYP719s）进行了系统进化分析。拟南芥 (A. thaliana) 和延胡索中的 CYP51s 被用作外类群（见图 2）。

分析结果表明，来自不同物种的 CYP719As 在系统发育树上聚为一类，具有约 60% 的序列相似性，并进一步分为四个亚类群。亚类群 I-IV 的 CYP719As 来源于胡椒属 (Piper)，分别参与胡椒酸和卡瓦内酯的生物合成中亚甲二氧桥的形成 [30, 31]。

亚类群 I-III 的 CYP719As 来源于鬼臼属 (Podophyllum)，它们参与了木脂素 (-)-Pluviatolide 中亚甲二氧桥的形成 [32]。催化原小檗碱类生物碱亚甲二氧桥形成的 CYP719As 聚集在同一分支中，并进一步分为两个亚类群（亚类群 I-I 和 I-II）。

CyCYP719A41 和 CyCYP719A42 与催化原小檗碱类生物碱 A 环上亚甲二氧桥形成的功能酶聚在一起 [20, 23, 33, 34]。而 CyCYP719A38、CyCYP719A39 和 CyCYP719A40 则与催化 D 环上亚甲二氧桥形成的功能基因聚在同一分支中 [21, 22, 35]。

参与亚甲二氧桥形成的功能性 CYP450 的系统进化分析

延胡索 (C. yanhusuo) 中的 CyCYP719A 以绿色圆点和紫色方块表示。每个分支的自举支持值基于 1000 次迭代计算。GenBank 的登录号列在附加文件 1：表 S2 中。

CyCYP719A 的功能鉴定

已对五种 CyCYP719A 进行了功能性鉴定，证实它们参与了 BIA 生物合成中亚甲二氧桥的形成。为了异源表达 CyCYP719A，研究人员利用了经过基因工程改造的 Saccharomyces cerevisiae WAT11，该酵母菌株过表达了来自拟南芥 (A. thaliana) 的 CYP450 还原酶 (CPR) [36]。

CyCYP719A 的表达通过半乳糖诱导，并从中提取了微粒体蛋白 [37]。随后，选择不同的原小檗碱类生物碱作为底物，体外验证了这些酶的活性。

UPLC-QTOF-MS 分析表明，CyCYP719A38、CyCYP719A39 和 CyCYP719A40 能够催化原小檗碱类生物碱 D 环上的亚甲二氧桥形成。它们催化底物 (S)-斯可鲁林 1 转化为 (S)-车叶碱 2（附加文件 1：图 S2、S3）。

此外，具有 97% 相似度的 CyCYP719A38 和 CyCYP719A39 均可催化含有 A 环亚甲二氧桥结构的 (S)-南地碱 6 转化为 (S)-斯蒂罗品 3，而 CyCYP719A40 则没有催化活性（附加文件 1：图 S2、S3）。

体外转化率的测定结果表明，CyCYP719A38 和 CyCYP719A39 的催化效率均高于 CyCYP719A40（图 3A，附加文件 1：表 S3）。当以 (S)-斯可鲁林 作为底物时，CyCYP719A38 和 CyCYP719A39 的转化率均超过 90%，而 CyCYP719A40 的转化率仅为 2%（图 3A，附加文件 1：表 S3）。

CyCYP719A 的体外酶活性测定结果

柱状图显示了相对于添加底物的转化率。

A: CyCYP719A 催化 (S)-斯可鲁林 1 转化为 (S)-斯蒂罗品 3。
B: CyCYP719A 催化 (S)-四氢古伦巴明 4 转化为 (S)-四氢小檗碱 5。

数据表示为 3 次重复分析的均值 ± 标准差 (P < 0.01；nd 表示未检测到)。

体外酶活性分析表明，CyCYP719A41 和 CyCYP719A42 能够催化原小檗碱 A 环上的亚甲二氧桥形成，并具有特定的底物区域选择性。

CyCYP719A42 的主要催化活性是催化 (S)-车叶碱 2 转化为 (S)-斯蒂罗品 3，转化率超过 90%（图 3A，附加文件 1：图 S2、S3、表 S3）。
CyCYP719A41 和 CyCYP719A42 还能够催化 (S)-斯可鲁林 1 生成 (S)-南地碱 6（附加文件 1：图 S2、S3）。
CyCYP719A42 在体外转化率约为 15%，显著高于 CyCYP719A41 的 5%（图 3A，附加文件 1：表 S3）。

研究表明：

CyCYP719A38、CyCYP719A39 和 CyCYP719A40 催化原小檗碱 D 环的亚甲二氧桥形成；
CyCYP719A41 和 CyCYP719A42 则催化 A 环的亚甲二氧桥形成。

通过比较转化效率，发现在 (S)-斯蒂罗品 的催化形成过程中，原小檗碱 D 环的亚甲二氧桥形成优先于 A 环的桥形成。

为了进一步研究 CyCYP719A 的底物区域特异性，筛选了 1-苄基异喹啉类和原小檗碱类生物碱，包括：

(S)-四氢古伦巴明、(S)-可可碱、(S)-去甲可可碱、(S)-N-甲基可可碱、(S)-雷氏碱、(S)-3'-羟基-N-甲基可可碱、小檗碱、紫堇碱、四氢掌叶防己碱、紫堇环素、古伦巴明。

其中，仅 (S)-四氢古伦巴明 被 CyCYP719A 利用为底物。

CyCYP719A41 能高效催化 (S)-四氢古伦巴明 4 转化为 (S)-四氢小檗碱 5，转化率超过 40%（图 3B，附加文件 1：图 S3，表 S3）。

不同的 CyCYP719A 基因表现出不同的底物偏好和转化率，为 BIA 合成生物学的研究提供了丰富的基因元件。

半理性突变分析揭示 CyCYP719A 区域选择性相关的关键残基

候选残基的选择

根据体外酶活性测定和相关研究，(S)-斯可鲁林 转化为 (S)-斯蒂罗品 需要两个具有严格底物区域特异性的 CYP719A，分别催化原小檗碱 A 环和 D 环的亚甲二氧桥形成。

为了找出影响 A 环和 D 环催化反应的关键残基，我们选择了具有较高催化活性的 CyCYP719A39 和 CyCYP719A42 进行突变分析。

通过同源建模和分子对接分析，选择了以下与催化活性相关的关键残基：

CyCYP719A39: Met120、Asp289 和 Ile474
CyCYP719A42: Ser125、Leu294 和 Val479

这些残基位于 CyCYP719A 的结合位点或活性中心，并在两个 CyCYP719A 酶之间存在差异，因此被选为半理性设计和分析的候选目标（图 4C）。

此外，靠近活性中心的氨基酸 Pro425 也被选择为候选残基，因为它与活性中心的血红素具有相互作用（图 4A、B）。将脯氨酸突变为具有最短侧链的丙氨酸，以观察 CyCYP719A 的功能变化。

最终，共选择了四个氨基酸残基作为候选活性位点，用于半理性设计，并构建了突变体库以进行体外功能鉴定。

CyCYP719A39 和 CyCYP719A42 的同源建模和分子对接分析

A: CyCYP719A39 与 (S)-斯可鲁林 的对接视图。
B: CyCYP719A42 与 (S)-车叶碱 的对接视图。

在图中：

血红素 以粉色棒状结构表示；
底物以黄色棒状结构表示。
C: 用于突变分析的四个选定残基。

突变体的功能鉴定

在体外酶活性测定中，选择了 (S)-斯可鲁林、(S)-车叶碱 和 (S)-南地碱 作为 CyCYP719A 的底物。

通过比较 CyCYP719A 突变体与野生型 CyCYP719A 的催化活性，进一步分析了突变体的功能特性（图 5A–D，附加文件 1：表 S4，图 S5）。

CyCYP719A 突变体相对于野生型 CyCYP719A 的转化率

A: CyCYP719A 突变体在催化 D 环 的甲二氧桥形成中的转化率，以 (S)-斯可鲁林 为底物生成 (S)-车叶碱。
B: CyCYP719A 突变体在催化 A 环 的甲二氧桥形成中的转化率，以 (S)-斯可鲁林 为底物生成 (S)-南地碱。
C: CyCYP719A 突变体在催化 A 环 的甲二氧桥形成中的转化率，以 (S)-车叶碱 为底物生成 (S)-斯蒂洛品。
D: CyCYP719A 突变体在催化 D 环 的甲二氧桥形成中的转化率，以 (S)-南地碱 为底物生成 (S)-斯蒂洛品。

数据以均值 ± 标准差 (SD) 表示，基于三次重复分析。** 表示 P < 0.01；nd 表示未检测到。实验数据详见附加文件 1：表 S4。

在 CyCYP719A39 和 CyCYP719A42 中，四个候选残基通过半理性突变进行了分析。功能鉴定表明：

L294 对于 CyCYP719A42 催化原小檗碱 A 环的甲二氧桥形成至关重要。
D289 则是 CyCYP719A39 催化原小檗碱 D 环甲二氧桥形成的关键残基。

在 CyCYP719A42 中，将 L294 突变为 D（CyCYP719A42L294D）导致其失去了催化 A 环甲二氧桥形成的能力（图 5C）。

而在 CyCYP719A39 中，将 D289 突变为 L（CyCYP719A39D289L）使其能够催化 A 环甲二氧桥形成，同时失去了催化 D 环的能力（图 5A, C）。

研究推测，CyCYP719A39D289L 突变体的活性口袋疏水性增加，从而减少了与底物 A 环的相互排斥作用，促进了底物 A 环上的羟基和氧甲基之间的反应，并缩短了与血红素的距离。这种结构变化使其更有利于原小檗碱 A 环的甲二氧桥形成（图 6A–B）。

同源建模与对接分析 CyCYP719A39 及其突变体 A. CyCYP719A39 与 (S)-scoulerine 的对接视图。 B. CyCYP719A39D289L 突变体与 (S)-scoulerine 的对接视图。 C. CyCYP719A39 与 (S)-scoulerine 的对接视图。 D. CyCYP719A39M120S 突变体与 (S)-scoulerine 的对接视图。 CyCYP719A39 的突变分析表明，S120 残基对于增强 CyCYP719A39 突变体的活性至关重要。将 M120S 突变引入 CyCYP719A39D289L（CyCYP719A39D289L, M120S）后，甲二氧桥形成的催化转化率提高了 2 倍以上（图 5B, C，附加文件 1: 表 S4）。CyCYP719A39M120S 突变体在 D 环上的甲二氧桥形成转化率提高了 20%（图 5A, D，附加文件 1: 表 S4）。此外，CyCYP719A42S125M 突变体导致 A 环甲二氧桥形成的催化活性降低 90%（图 5C，附加文件 1: 表 S4）。这些结果同样适用于 S120 的单突变以及多个残基的组合突变（图 5A–D，附加文件 1: 图 S5）。我们推测，在 CyCYP719A39M120S 突变体中，突变体活性口袋近端的疏水性降低，增加了突变体与底物 A 环的相互排斥作用，使底物 D 环更接近血红素，从而促进了 D 环上的羟基和氧甲基反应。然而，当 D289L 和 M120S 同时突变时，CyCYP719A39D289L, M120S 突变体更可能减少与底物 A 环的相互排斥作用，促进 A 环上的羟基和氧甲基的高效反应。 D 环的甲二氧桥形成可能先于 A 环的形成。因此，我们进一步研究了能够催化原小檗碱类生物碱 D 环和 A 环上甲二氧桥形成的突变体。研究表明，D289 对于 CyCYP719A39 催化原小檗碱类生物碱 D 环上的甲二氧桥形成至关重要，而 L294 对于 CyCYP719A42 催化 A 环上的甲二氧桥形成起关键作用。对这些残基进行突变会导致 CyCYP719A39 和 CyCYP719A42 失去原有功能。然而，我们发现，尽管 CyCYP719A39D289L 突变体完全失去了 D 环甲二氧桥形成的催化能力，它却获得了催化 A 环甲二氧桥形成的功能。此外，CyCYP719A39P425A, D289L 双突变体可以催化 (S)-scoulerine 通过 (S)-cheilanthifoline 转化为 (S)-stylopine，尽管这两个反应不能同时进行（该双突变体无法在体外直接催化 (S)-scoulerine 转化为 (S)-stylopine，需要分步催化）（图 5A, C）。同时，CyCYP719A39P425A, D289L 还能催化 (S)-scoulerine 转化为 (S)-nandinine（图 5B），说明该突变体可以催化 (S)-scoulerine A 环和 D 环上的甲二氧桥形成。对接分析表明，CyCYP719A39 中的 P425 最接近活性位点血红素并与其相互作用。我们推测，引入 P425A 突变降低了 CyCYP719A39P425A 与底物的相互作用，导致 D 环远离血红素，从而降低其催化活性。然而，引入 D289L 突变后，双突变体 CyCYP719A39P425A, D289L 与底物 A 环的相互排斥作用减弱，使其能够同时催化原小檗碱类生物碱 A 环和 D 环的甲二氧桥形成。为了提高 CyCYP719As 在催化 A 环和 D 环甲二氧桥形成方面的效率，仍需进一步进行迭代突变分析。

(S)-stylopine 的从头合成

(S)-stylopine 在延胡索（C. yanhusuo）和白屈菜（Chelidonium majus）等罂粟科植物中的含量较低，但具有良好的抗炎和抗纤维化生理活性 [4,5,38]。然而，其分子中含有两个甲二氧桥，使得化学合成较为困难。因此，我们采用合成生物学方法，构建了工程化酵母菌株，以实现 (S)-stylopine 的微生物合成。在此前的研究中，我们构建了酿酒酵母菌株 XJ0695，该菌株通过代谢工程和合成生物学策略优化了 (S)-scoulerine 的生物合成途径（数据未发表）。该菌株的构建起始于由酪氨酸衍生的多巴胺和 4-HPAA 在 norcoclaurine synthase (NCS) 催化下缩合生成 (S)-norcoclaurine。为了提高 (S)-norcoclaurine 的产量，我们进行了多种优化尝试，包括筛选最佳候选酶（来自甜菜 Beta vulgaris 的 CYP76AD5 和来自 Coptis japonica 的 CjNCS）、增加酪氨酸前体供应（过表达酿酒酵母自身的 ARO1, ARO2, ARO3，并表达来自大肠杆菌的 EcAROL、来自蒺藜苜蓿的 MtPDH1 以及两个突变体 ARO4* (K229L) 和 ARO7* (G141S)）、减少 4-HPAA 的副反应损失（删除 ARI1, ADH6, YPR1, GRE2 和 HFD1 基因）、提高限速酶拷贝数（3 拷贝的 CjNCS）以及引入植物来源的酪氨酸和 4-HPAA 生物合成途径。随后，我们将生物合成途径延伸至关键中间体 (S)-scoulerine 的合成。

为了构建从头合成 (S)-stylopine 的酵母菌株，我们将已鉴定的 CyCYP719As 及其突变体引入 (S)-scoulerine 生产平台，以催化合成 (S)-stylopine。为了比较不同酶的催化效果，我们分别使用 CyCYP719A39 和 CyCYP719A39MS 突变体，与 CyCYP719A42 共同构建重组质粒，并将其转入含有拟南芥 ATR1 基因的 (S)-scoulerine 酵母平台中。发酵 72 小时后，以 20 g/L 葡萄糖为碳源，20 g/L 半乳糖诱导表达。结果表明，表达 CyCYP719A39 和 CyCYP719A42 的菌株 XJ0695 能够在体内合成 (S)-stylopine（图 7A），但同时积累了一定量的 (S)-scoulerine。而表达 CyCYP719A39MS-CyCYP719A42 突变体的菌株，其 (S)-stylopine 产量提高约 10%，达到 32 mg/L（图 7B，附加文件 1: 表 S5）。我们成功构建了一个工程化酵母菌株，实现了 (S)-stylopine 的从头合成，并进一步验证了 CyCYP719As 突变体能够提高目标产物的产量。该方法为利用合成生物学生产植物天然产物提供了新的酵母菌株。未来，我们将进一步优化 (S)-scoulerine 向 (S)-stylopine 转化的效率，以实现高产甲二氧桥化合物的目标。

UPLC-MS 分析工程化酿酒酵母菌株生产的 (S)-stylopine

A. 提取离子色谱图（EICs），显示酵母菌株 XJ0695 表达 CyCYP719A39-CyCYP719A42（粉色）或 CyCYP719A39M120S-CyCYP719A42（绿色）所产生的 (S)-stylopine。 B. 酵母菌株 XJ0695 表达 CyCYP719A39-CyCYP719A42（粉色）或 CyCYP719A39M120S-CyCYP719A42（绿色）时的 (S)-stylopine 产量。数据均来自三次重复实验的平均值 ± 标准差（SD）。

讨论

CYP450 是植物天然产物生物合成中的关键修饰酶，为活性化合物提供甲基化和糖基化的基团 [8]。CYP719 是 CYP450 的一个独特家族，其中大多数成员参与苄基异喹啉类生物碱（BIAs）的生物合成 [34]。在本研究中，我们从延胡索（C. yanhusuo）克隆并鉴定了五个 CyCYP719A 基因。体外酶活性实验表明，这五个基因的氨基酸序列相似度约为 60%，均可催化原小檗碱类生物碱中的甲二氧桥形成，但在底物区域特异性上存在差异。CyCYP719A38、CyCYP719A39 和 CyCYP719A40 主要催化 D 环的甲二氧桥形成，而 A 环的甲二氧桥形成由 CyCYP719A41 和 CyCYP719A42 催化。通过对关键氨基酸残基的分析，我们鉴定出与原小檗碱类生物碱 A 环和 D 环甲二氧桥形成相关的关键位点，为 CyCYP719As 的催化特异性提供了结构-功能关系的参考。基于 BIAs 生产菌株，我们将 CyCYP719A39、CyCYP719A42 及其突变体引入 (S)-scoulerine 生产平台，实现了 (S)-stylopine 的从头合成，产量达到 32 mg/L。该工程化酵母菌株为 (S)-stylopine 的生物合成提供了一种替代策略。

尽管 CYP450s 在氨基酸序列上的相似度不同，但它们都具有相同的三维折叠结构和催化中心 [39]。这一结构特性使得通过少量残基突变即可改变其催化活性，这对于缺乏晶体结构的植物 CYP450 进行蛋白质工程改造具有重要意义。在没有晶体结构的情况下，基于半理性设计的蛋白质工程方法为研究 CYP450 的催化机制及其改造提供了可行的策略。本研究结合同源建模、分子对接和序列比对，鉴定出影响 CyCYP719As 底物区域特异性的关键残基（CyCYP719A42 的 Leu294 和 CyCYP719A39 的 Asp289）。我们推测，在 CyCYP719A39D289L 突变体中，由于 Asp289 被含有多个甲基基团的 Leu 取代，活性口袋的疏水性增加，从而减少了突变体与底物之间的排斥作用，使得 A 环的甲二氧桥更接近血红素，而 D 环则远离血红素。此外，对 CyCYP719A39D289L 的功能鉴定结果表明，该突变体失去了 D 环甲二氧桥形成的催化能力，但获得了 A 环的催化能力，从而验证了上述假设。在此基础上，进一步引入 M120S 突变后，CyCYP719A39D289L, M120S 突变体的催化活性增强，这可能是因为该突变降低了 A 环与血红素之间的空间位阻。另一方面，CyCYP719A42L294D 突变体失去了催化 A 环甲二氧桥形成的能力。此外，我们发现 CyCYP719A39 的 M120S 突变可以通过降低活性口袋近端的疏水性，并缩短 D 环与血红素的距离，提高其催化效率。同时，我们获得了一个双突变体 CyCYP719A39P425A, D289L，该突变体能够连续催化 A 环和 D 环的甲二氧桥形成，尽管其转化率较低。进一步的迭代突变分析将有助于揭示该突变体实现连续催化的机制，并优化其催化效率，以获得能够高效催化 A 环和 D 环甲二氧桥形成的突变蛋白。此外，我们通过在 (S)-scoulerine 生产平台中引入不同的 CyCYP719As 及其突变体，微调了 (S)-stylopine 的合成产量。

综上所述，我们对五种参与 BIAs 生物合成的 CyCYP719As 进行了功能鉴定，并通过定点突变和体外酶活性实验鉴定了 A 环（CyCYP719A42 的 Leu294）和 D 环（CyCYP719A39 的 Asp289）甲二氧桥形成的关键残基。最终，我们成功构建了可生产 (S)-stylopine 的工程化酵母菌株，为 BIAs 化合物的生物合成提供了一种新的策略。这些研究结果拓展了我们对 CYP719As 介导的甲二氧桥形成的结构-功能关系的理解，并为利用合成生物学生产 BIAs 类天然产物奠定了基础。

材料与方法

植物材料与化学试剂

延胡索（C. yanhusuo）的鳞茎采集自中国浙江省磐安县的传统产区。样品采集后立即冷冻于液氮中，并储存于 -80°C。纯度≥95% 的 (S)-小檗碱 [(S)-scoulerine]、(S)-stylopine、(S)-cheilanthifoline、(S)-nandinine、(S)-四氢白屈菜红碱 [(S)-tetrahydrocolumbamine] 和 (S)-四氢小檗碱 [(S)-tetrahydroberberine] 均购自上海源叶生物科技公司。

CyCYP719As 基因克隆

使用 Total RNA Kit（天根生化，TIANGEN，中国）提取总 RNA，并测定其纯度和完整性。采用 Superscript™ IV 逆转录酶（Invitrogen，美国）将延胡索鳞茎中的总 RNA 逆转录为 cDNA。根据实验室获得的转录组数据，筛选出五个 CyCYP719As 亚家族基因，并基于其开放阅读框（ORF）设计特异性引物。引物设计时选取 Spe I 限制性位点（详见附加文件 1：表 S1）。使用 PrimeSTAR® HS DNA 聚合酶（Takara，日本）扩增目的片段，并通过 Quick Gel Extraction Kit（全式金生物，TransGen，中国）纯化 PCR 产物。随后，将目标片段无缝连接到真核表达载体 pESC-His [40]，并将重组质粒转化至大肠杆菌 Trans1 T1 中。通过 PCR 检测和 DNA 测序确认阳性克隆，并使用 Plasmid Miniprep Kit（全式金生物，TransGen，中国）从菌株中提取重组质粒 pESC-His-CyCYP719As。

CyCYP719As 的功能鉴定

将重组质粒 pESC-His-CyCYP719As 转化至过表达拟南芥 CYP450 还原酶（CPR）的酿酒酵母 WAT11 菌株 [36]，并接种于 SD-His 缺陷型固体培养基中，于 30°C 培养直至单菌落形成。随后，将阳性单菌落接种至 SD-His 液体培养基中，培养至 OD600 值达到 2–3 后，加入 20 g/L 半乳糖诱导蛋白表达。采用 TESB 方法提取微粒体蛋白，具体操作参照 Ma 等人的研究 [41]。此外，将空载体 pESC-His 转化至 WAT11 以作为阴性对照，并按照相同方法提取微粒体蛋白。

CyCYP719As 的体外功能鉴定如下：反应体系总量 500 μL，包括 0.5 mg 微粒体蛋白、1 mM NADPH、100 μM 底物以及再生系统（4 mM 葡萄糖-6-磷酸（G6P）、1 U 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6P-DH）、5 μM 黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、5 μM 黄素单核苷酸（FMN）和 2 μM 二硫苏糖醇（DTT））。反应体系在 30°C 震荡孵育 3 h 后，用 500 μL 乙酸乙酯多次提取，收集上清液并用氮气吹干，然后溶解于 200 μL 甲醇中，进行 UPLC-QTOF-MS 检测。CyCYP719As 在微粒体中的蛋白浓度通过消光系数法估算，并用于定量研究 [40]。酶促反应的转化率计算方法为：转化率 = 产物峰面积 /（底物峰面积 + 产物峰面积）× 100%。

UPLC-QTOF-MS 分析

使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）检测催化产物。色谱分离采用 Waters Atlantis T3 柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）。酶催化产物的梯度洗脱采用流动相 A（0.1% 甲酸（v/v）+ 99.9% 乙酸（v/v））和流动相 B（0.1% 甲酸水（v/v）），流速为 0.4 mL/min。具体洗脱程序参考 Liu 等人的研究 [40]。每次进样体积为 1 μL，使用 Waters Xevo G2-S QTOF 质谱仪在正离子模式下进行检测。全扫描范围为 50-1000 Da，扫描时间 0.1 s，碰撞能量梯度设定为 40-60 V。数据分析使用 MassLynx（Waters Technologies）软件。所有体外酶活性测定均重复三次。

同源建模与半理性设计

采用 AlphaFold2 平台对 CyCYP719A39 和 CyCYP719A42 进行蛋白同源建模，并选择相似性最高的模型。通过 PDB 数据库筛选模板，结合序列比对和二级结构预测，构建多个模型 [42]。利用 AutoDock4 软件进行 CyCYP719A39 和 CyCYP719A42 与底物 (S)-scoulerine 和 (S)-cheilanthifoline 的分子对接，并使用 PyMOL 进行对接结果可视化分析，识别关键残基 [43]。

以 pESC-His-CyCYP719A39 和 pESC-His-CyCYP719A42 质粒为模板扩增突变体，引物详见表 S1。通过无缝克隆方法构建包含突变序列的重组质粒，并将其转化至 WAT11 菌株中表达。突变体的功能鉴定方法与野生型 CyCYP719As 相同。所有体外酶活性测定均重复三次。

酿酒酵母培养及 (S)-stylopine 生产

以研究团队提供的 S. cerevisiae XJ0695 菌株（可生产 (S)-scoulerine）为基础，在其 YORWΔ17 位点整合拟南芥 ATR1 基因，并引入 CyCYP719A39、CyCYP719A39MS 突变体及 CyCYP719A42，以在体内功能验证并生产 (S)-stylopine。由于工程酵母缺乏 Ura 标记，构建 pESC-Ura-CyCYP719As 载体，并将其转化至工程酵母后，在 Ura 缺陷型液体培养基中培养。

发酵过程在摇瓶中进行，以 20 g/L 葡萄糖为唯一碳源，培养至 OD600 值达到 3 后，加入 20 g/L 半乳糖诱导表达。反应产物使用等体积 30% 乙腈提取，离心后用 15% 乙腈稀释，并进行 UPLC-QTOF-MS 分析。以携带 pESC-Ura 载体的工程酵母为阴性对照。所有体外酶活性测定均重复三次。