Water Research | 南科大夏雨组揭示Anammox菌群微米级空间异质性和保守互作

Water Research: 南方科技大学夏雨团队揭示Anammox菌群微米级分辨率空间异质性和保守互作

微米尺度生物地理学视角揭示Anammox细菌属水平内保守空间关联

Micron-scale biogeography reveals conservative intra anammox bacteria spatial co-associations

Article, 2022-5-20

Water Research [IF: 11.236]

DOI: https://doi.org/10.1016/j.watres.2022.118640

第一作者：Liming Chen (陈立明); Bixi Zhao (赵碧溪)

通讯作者：Yu Xia (夏雨)

合作作者：Alejandro Palomo; Yuhong Sun (孙瑜鸿); Zhanwen Cheng (程战文); Miao Zhang (张淼)

主要单位：南方科技大学环境科学与工程学院 (School of Environmental Science and Engineering, College of Engineering, Southern University of Science and Technology)

摘要

Abstract

微米级分辨率空间关系解析可以协助识别复杂微生物群落内部真实的种间相互作用。尽管人们普遍认识到代谢互作对厌氧氨氧化（Anammox）系统性能的关键作用，但少有研究以微米级分辨率揭示Anammox菌群内部微生物相互作用。基于此，研究者对实验室规模的Anammox反应器中不同尺度的菌群进行了广泛的采样（共242个样本）分析，包括传统bulk尺度（~cm, 6个）、宏观尺度（300-500 μm, 70个）以及微米尺度（70-100 μm, 166个）。该研究首次观察到Anammox菌群在微米尺度呈现出显著的空间异质性，Anammox细菌（Ca. Brocadiales）的相对丰度在各个微米级颗粒群落中呈现显著波动（2.0-79.3%），表明在控制良好和混合良好的条件下，微生物相互作用在Anammox菌群群落构建过程中起关键作用。重要的是，通过绘制微米级分辨率Anammox菌群内部的空间关联网络，研究者发现Anammox细菌的时间尺度保守空间关联仅限于三个不同的Brocadia物种，而它们与异养微生物之间的空间关联则是随机的，这意味着Anammox细菌与其他异养微生物之间不存在统计学意义上的共生关系。进一步的宏基因组分析结果表明，次级信使c-di-GMP相关的群体感应效应可能介导了Brocadia物种之间的保守合作。这些结果为我们提供了有关Anammox菌群社会行为的新认识。综上，描绘微米级分辨率菌群结构为解析微生物群落的空间结构和相互作用开辟了一条新途径。

引言

Introduction

在大多数复杂的微生物群落中，相互作用发生在微米级尺度(~100 μm)。微米尺度的细胞群落内，细胞与细胞之间的距离很短，可扩散的代谢物很容易被临近细胞获取而不是流失到环境中。此前学者们提出了各种网络模型算法，以从微生物群落数据中推断出微生物相互作用网络。根据这些基于相关性的方法，正向关系表明物种间的合作性，负向关系则表示物种间的竞争性。然而，这些推断方法受到相互作用依赖的空间尺度(~μm)和传统的微生物群落样本尺度(mm~cm)之间不匹配的限制。此外，大多数复杂的微生物群落表现出明显的细尺度异质性，而传统的大尺度或批量样本只能提供数千个亚群的平均信息，未能表征菌群空间异质性、空间分布等信息。因此，从大规模样本中推断所得物种相互作用网络很可能是由于对非生物因素(如pH、氧气)的共同响应，而不是真正的微生物相互作用，由此甚至可能产生过度拟合的微生物相互作用网络(图1a)。为准确揭示微生物之间相互作用，必须超越宏观分析，关注具有足够通量和统计关联的微米级分辨率空间模式。

图1 样品尺寸对互作网络推断的影响以及微米尺度采样示意图。(a) 传统样品共现分析会扩大互作网络，微米尺度样品共现分析更接近真实互作网络，网络结构中实线表示显著关联，虚线表示无显著关联; (b)微米尺度样品采集及PCR扩增示意图。

了解微生物工艺系统中的微生物相互作用对于改善和优化系统的稳定性和性能至关重要。Anammox工艺作为传统生物脱氮技术的节能替代品已经引起了学者们的广泛关注。以往研究指出，自养硝化细菌和异养反硝化细菌在Anammox富集培养物中无所不在，Anammox和异养菌之间普遍的代谢互作促进了整个系统的脱氮性能。以上研究结论主要是根据大尺度样本内潜在合作伙伴之间的代谢互补或功能冗余途径推断所得，少有利用FISH的原位微米级空间信息或其它微米级分辨率统计手段来验证合作菌属间的空间位置关系。截至目前，Anammox菌群的微米级微生物空间关联，甚至任何其它复杂微生物工艺系统的微米级分辨率空间关联网络均未得到较好研究，这显然限制了我们对生物废水处理期间支撑菌群功能有效性的微生物互作的理解。

综上所述，在这项研究中，研究者成功地建立了微米尺度采样(图1b)以及微米级分辨率(70-100 μm)的Anammox菌群空间关联网络分析。结合宏基因组功能注释分析，进一步探讨了Anammox菌群内部代谢互作机制。该研究的目标主要有如下三点：1) Anammox菌群微米级分辨率空间异质性水平；2) Anammox细菌在群落内部是否存在保守的协作伙伴，以及3) 这些保守伙伴的系统发育和功能分歧。这项研究将加深我们对Anammox菌群的空间结构和互作网络的理解，使我们能够对与群落构建或演替有关的生态过程进行机理分析。此外，这项工作中开发的实验方案和分析流程为人工系统和自然环境中微生物相互作用的研究提供了新的范式。

结果

Result

Anammox菌群微米级分辨率空间异质性

Spatial heterogeneity of anammox consortia at micron-scale

图2 Anammox单颗粒菌群的高度异质性表征。(a) 不同尺度样品群落组成分析; (b) 宏观尺度和微观尺度样品物种丰富度比较; (c) 物种丰度的变异系数表征空间异质性。

该研究分别在Anammox反应器运行的T1(5d)和T2(65d)时刻采样，样品包括：T1和T2时刻各3个bulk尺度样品(~cm)，T1和T2时刻分别36和130个micron尺度样品(70-100 μm)，T2时刻70个macro尺度样品(300-500 μm)。Bulk尺度样品为传统方法样品，micron和macro尺度的样品都是单个Anammox颗粒样品。T1和T2时刻微米(micron)尺度样品的比较用于考察在时间上的演替，T2时刻micron和macro尺度样品比较用于考察尺寸效应。整个Anammox混合菌群以OTU1048(Anammox bacteria, Brocadia fulgida)为主，平均丰度为34.52%，其次是OTU1 (Rhodocyclaceae, 14.70%)和OTU2 (Rhodocyclaceae, 11.09%) (图2a)。所有Anammox细菌均隶属于Brocadia属和Jettenia属，其中OTU1048 (Brocadia fulgida)和OTU13 (Jettenia sp.)分别占总厌氧氨氧化细菌的91.8%和2.4%。研究表明Anammox菌群在微米尺度呈现出显著的空间异质性(图2a)，Anammox细菌在micron颗粒群落中的丰度波动极大(2.0-79.3%)，在T1和T2时刻其相对丰度变异系数分别为0.56和0.39，某些物种的丰度波动甚至横跨三个数量级，如T2时刻micron尺度Acidimicrobiales相对丰度变异系数达6.15(图2c)。

图3 Anammox单颗粒群落的β多样性分析。(a) T2时刻不同尺度样品异质性比较; (b) T2时刻不同尺度样品β多样性表征; (c) T2时刻micron和macro尺度样品内部差异大小比较。

然后研究者探究了菌群异质性表征时存在的尺寸效应。研究结果表明，micron尺度样品的空间异质性要显著高于macro样品的空间异质性。Macro与bulk样品呈现出相似规律，后者的空间异质性较之前者低一个数量级(图3a)。β多样性的差异分析进一步揭示micron尺度样品内部的差异要显著大于macro尺度样品的内部差异(图3c)。这些结果表明传统bulk尺度采样或宏观分析会损失样品重要的空间信息，而这正是正确解析复杂微生物群落内部互作关系的关键。

Anammox菌群微米级分辨率空间关联网络

Spatial association networks of anammox consortia at micron-scale

图4 基于Anammox单颗粒群落的空间关联网络分析。(a) Venn图展示了不同时刻和不同尺度样品中用于空间关联网络分析的OTUs集合之间的关系; (b) T2时刻macro尺度Anammox菌群空间关联网络; (c) T2时刻micron尺度Anammox菌群空间关联网络; (d) T1时刻micron尺度Anammox菌群空间关联网络。

确定Anammox菌群微米级分辨率后，研究者进一步考察菌群内部微米级分辨率空间关联网络。研究者首先关注了分析尺度对空间关联网络的影响，结果表明，T2时刻，macro尺度网络结构较之micron要明显复杂(图4b, c)，后者网络结构中Anammox细菌的空间关联只存在于Anammox细菌Brocadia属内(OTUs 1048, 759, 824和1059)，而macro尺度的网络结构中还包括一些与OTU1048呈显著负相关的物种OTU42 (Nitrosomonadaceae)和OTU40 (Gemmatimonadetes)。此外，macro尺度上，低丰度Anammox细菌OTU13 (Jettenia sp.)与异养菌OTU19 (Ignavibacteriaceae)存在显著的正相关空间关联。

然后研究者考察了micron尺度网络结构在时间尺度上的演替。结果表明，T1时刻网络结构包含37个节点和61条边(图4d)，而T2时刻则锐减至10个节点8条边。T1时刻网络结构中的5个高连接度节点[OTU1048, OTU759, OTU313 (Comamonadaceae), OTU64 (Hyphomicrobium)和OTU417 (Thauera)]中的后3个在T2时刻全部消失。重要的是，研究者发现时间尺度上Anammox细菌的保守互作关系只存在于Anammox细菌Brocadia属内(OTUs 1048, 759和824)，且Anammox细菌与其它异养菌之间并不存在显著的空间关联。

Anammox菌群宏基因组解析

Anammox consortia metagenomic insights

图5 基于Anammox细菌基因组和群体感应相关基因的进化分析。(a) 基于Anammox细菌基因组的进化关系分析，红色是本研究所得基因组草图，黑色是参考基因组; (b-c) RpfB 和 RpfG 基因进化关系分析，右边图展示的该基因对应预测蛋白的结构域、信号肽和无序区。

为揭示Aanmmox菌群潜在功能概况，研究者对T1时刻的bulk尺度样品进行了宏基因组测序分析，组装获得了50个基因组(MAGs) (完整性≥70%，污染≤10%)。系统发育分析表明其中三个MAG被归类为Anammox细菌，即AMX1 (Brocadia sapporoensis)、AMX2 (Brocadia fulgida)和AMX3 (Jettenia caeni)。进一步功能注释结果表明三种Anammox细菌均含有c-di-GMP的合成或调解基因(RpfB和RpfG) (图5)，c-di-GMP是Anammox菌群中调节群体感应过程的重要信号分子。尽管群体感应相关基因的预测蛋白在Brocadia和Jettenia中具有相同的Pfam结构域，但预测蛋白的无序区和信号肽却有所不同（图5b，c）

讨论

Discussion

细胞间的代谢互作影响微生物群落构建，从而影响其在生态系统中的功能。目前大部分研究一般通过共现网络分析来解读复杂微生物群落内部的微生物相互作用。最近，一些研究对基于相关性推断微生物互作的方法提出了挑战。大多数方法不考虑样品空间异质性，只是提供由大量亚群落组成的bulk样本的平均信息，并且由于辛普森悖论、背景依赖和非线性平均等现象的存在，很容易掩盖微生物互作的真实信号。因此，在适当的规模上识别和表征空间异质性可能会提供一个更好和更精确的对Anammox菌群内部微生物相互作用的理解途径。

理论上，随机性（如扩散限制）和确定性（如环境条件和生物相互作用）过程共同决定群落构建，从而使得微生物群落在空间或时间上表现出差异。Anammox反应器系统内部存在充分的混合，扩散限制作用可以忽略不计。因此，微米尺度上Anammox群落组成的巨大空间变化表明，在控制良好和混合良好的条件下，微生物相互作用在群落构建中发挥了重要作用。重要的是，研究结果表明传统微生物群落分析方法仅限于宏观的种群评估，而损失了重要的空间信息。

以往基于宏基因组学和宏转录组学分析的研究表明Anammox系统中，Ignavibacteria和Anaerolineae分解和清除Anammox细菌产生的胞外肽和碎屑，Anammox细菌为这些伙伴提供必要的维生素B，二者存在普遍的代谢互作，形成良好的合作关系。然而该研究在微米尺度上并未观察到Anammox细菌与其它异养菌之间显著的空间关联，即异养菌与Anammox细菌之间的距离普遍相隔至少100 μm，这显然超过了复杂体系中微生物代谢产物传递的有效距离。值得提出的是，Rhodocyclales（OTU1和OTU2）是Anammox菌群中最丰富的分类群之一，但始终缺乏与其他分类群的共现。尽管以前认为Rhodocyclales和Anammox细菌是共生的互作伙伴，但该研究并未观察到这两个优势种群之间存在统计学意义的空间关联。因此，Anammox系统内的异养菌可能只是单纯充当废物清道夫，协助清除Anammox细菌产生的碎屑和胞外肽，而不是作为协调Anammox细菌代谢的合作者。

值得提出的是，该研究发现Anammox细菌的保守空间关联只存在于Anammox细菌Brocadia属内部(OTUs 1048, 759和824)。研究者指出这种保守空间关联的生态基础可能是双重的。首先这三种Brocadia物种的微尺度空间关联可能意味着不同Aanmmox细菌对生长和繁殖最佳条件的相似响应。OTU1048 (Brocadia fulgida)具有较低的底物亲和力和高生长速率，属于R-策略细菌，而OTU759和OTU824 (Brocadia sp. 40)具有较高的底物亲和力和低生长速率，属于K-策略细菌，因此最终OTU1048占主导。其次，据以往报道，微米尺度上微生物的紧密关联总是揭示互利甚至是不可分离的共生关系，保守的微米尺度空间关联同样可能反映了这些Brocadia物种之间的合作趋势。此前的研究已经证实，Anammox细菌活性高度依赖于细胞密度，群体感应效应在促进Anammox群落聚集和脱氮活性中发挥了关键作用。因此，研究者推测三种Brocadia细菌聚集并形成微米尺度的空间联盟，以最小化联盟内的信号分子梯度，进而有效调控其团聚和脱氮活性。

该研究以微米级分辨率揭示了Anammox菌群的空间异质性和空间关联网络，对Anammox菌群内部的社会行为提出了新的见解。该方法与研究微生物群落活性组分的方法相结合，有可能有助于在微米尺度上理解自然环境中(如土壤和沉积物)复杂微生物群落内部的相互作用网络。此外，该方法可以与全基因组扩增技术相结合，在微米尺度上捕获单个亚群落的功能信息，使我们能够在功能水平上以微米级分辨率解析微生物相互作用。

参考文献

Liming Chen, Bixi Zhao, Alejandro Palomo, Yuhong Sun, Zhanwen Cheng, Miao Zhang, Yu Xia1. (2022) Micron-scale biogeography reveals conservative intra anammox bacteria spatial co-associations. Water Research, https://doi.org/10.1016/j.watres.2022.118640

第一作者简介

第一作者：陈立明博士，2019年毕业于北京大学，现为南方科技大学环境科学与工程学院研究助理教授。主要关注人工系统中厌氧氨氧化（Anammox）菌群的活性、代谢和相互作用机制，以及自然生态系统中Anammox菌群的多样性和群落构建机制。

共同第一作者：赵碧溪，南方科技大学环境科学与工程学院夏雨课题组在读硕士生。主要关注厌氧消化过程中的共生菌（Syntrophs）产甲烷机制，厌氧微生物群落中的胞外电子传递（DIET及EET）菌群的鉴定和生态功能。

通讯作者简介

夏雨：夏雨博士，香港大学水资源与环境工程博士。现任南方科技大学环境科学与工程学院副研究员（博士生导师），环境微生物与生态基因组学实验室负责人。研究兴趣集中于：结BONCAT, Single-cell，DNA-SIP等先进分子生物学手段、以Nanopore测序为代表的单分子高通量测序技术以及生物信息学大数据分析，解密生物处理反应器、极端自然系统及洁净室内环境中微生物群系的群落构建原理、功能调控机制以及关键基因（耐药基因）水平转移规律。近五年来在The ISME Journal, Microbiome, Chemical Engineering Journal, Environmental Science & Technology, Water Research 等顶级期刊发表论文30余篇，总引用次数 2700余次（Google Scholar）。现任中国工程院院刊Engineering (SCI impact factor 6.495) 青年通讯专家、iMeta 青年编委、Frontiers in Energy Research (SCI impact factor 2.746) 编委。应邀在国际会议做报告20余次，1次担任分会主席，1次大会报告；曾担任南方科技大学教授委员会环境科学与工程学院代表委员，美国微生物协会香港地区青年大使。

Dr Yu XIA, PI of the Environmental Microbiology and Ecogenomics Laboratory at School of Environmental Science and Engineering, Southern University of Science and Technology (SUSTech), Shenzhen, China. Dr Yu XIA got her PhD on Environmental Microbiology from The University of Hong Kong. She is interested in applying advanced sequencing and molecular technology such as long-read based metagenomics, microfluidics and single-cell to explore the functionality of the unculturable majority of environmental microbiome in engineered systems, indoor environments and extreme environments.

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