酶传感器+酶联免疫吸附分析法ELISA（部分）

1 课程重点概况
2 重点内容梳理
- 2.1 酶生物传感器
- - 2.1.1 酶传感器的检测原理
  - 2.1.2 酶的固定技术
  - - 2.1.2.1 聚合物包埋
    - 2.1.2.2 表面吸附
    - 2.1.2.3 共价结合
    - 2.1.2.4 静电相互作用
    - 2.1.2.5 特定的共价作用
    - 2.1.2.6 生物特异性的相互作用
  - 2.1.3 以血糖仪为例的三代产品原理
  - - 2.1.3.1 第一代葡萄糖传感器——Clark氧电极型
    - 2.1.3.2 第二代葡萄糖传感器——电子媒介体型
    - 2.1.3.3 第三代葡萄糖传感器——直接电子传递型
- 2.2 双抗体夹心ELISA法原理

1 课程重点概况

4月1日（周四）第二次课程主要介绍了酶传感器+酶联免疫吸附分析法ELISA（部分）
需要掌握的内容如下：
1、简单了解酶生物传感器，包括酶传感器的检测原理、酶的固定技术、以血糖仪为例的三代产品原理等。
2、掌握双抗体夹心ELISA法原理（还有几种ELISA方法，下节课介绍）。ELISA方法是免疫传感器实现的基础，务必牢牢掌握。

2 重点内容梳理

2.1 酶生物传感器

2.1.1 酶传感器的检测原理

酶传感器主要是利用酶作为生物识别元件，然后利用酶和底物之间的相互作用去做到检测底物，通常用的换能器是电化学的这种手段检测电信号。

酶是能够催化体内特定生物化学反应的多肽类蛋白质，它们能加速某个生化物质（即底物）的反应速率但在反应过程中不被消耗。这是酶的催化工作原理。酶在与底物反应的过程中，形成酶底物分子复合物，在适当的条件下，形成所需要的产物分子并最终释放酶。

2.1.2 酶的固定技术

酶电极制备过程中的关键在于酶的固定化。固定化的目的在于保持酶稳定性的同时，尽可能使酶膜与敏感元件紧密接触，这样酶催化反应的产物可以很快地被酶敏感元件所感知并产生相应的信号。
酶的固定化技术

2.1.2.1 聚合物包埋

把酶用这样聚合物包起来，然后再跟电极或者说其他的一些固载机制的表面结合在一起。

2.1.2.2 表面吸附

利用一些非特异性相互作用，比如说疏水作用等等，达到固定识别元件的目的。现在的酶传感器当中，主要是达到酶的固定的目的。

2.1.2.3 共价结合

主要通过一些化学键，比如固载机制的表面如果带有一个羧基，假如它是一个活性集团，这时酶如果是蛋白质的话，蛋白质末端的氨基和羧基之间是可以发生缩合反应的，所以相当于通过共价相互作用，把酶固定在固载机制的表面。

2.1.2.4 静电相互作用

利用正负电荷之间的相互作用，比如说固载机制表面如果带有负电荷，酶如果带正电荷，那它们之间就可以有一些静电相互作用，从而达到酶在固定在固载机制表面。

2.1.2.5 特定的共价作用

比如二硫键，电化学检测的时候常用的工作电极是金电极（金可以形成一个稳定的金硫键）。这些都是一些特定的、特别稳定的一些共价相互作用

2.1.2.6 生物特异性的相互作用

比如说生物素和亲和素，这是一对相互作用的分子，它们相互作用的结合比例，是一个亲和素可以结合四个生物素。

2.1.3 以血糖仪为例的三代产品原理

在这里插入图片描述

2.1.3.1 第一代葡萄糖传感器——Clark氧电极型

由一种称为Clark型氧电极来制备，用透气膜将酶包裹固定在氧电极表面。葡萄糖传感器通常使用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,GOD），该传感器对葡萄糖具有选择性响应。主要检测氧的消耗或过氧化氢的生成。其检测原理为：
${C_6H_{12}O_6+O_2+H_2O}\stackrel{GOD}{\longrightarrow}{C_6H_{12}O_7+H_2O_2}$
${O_2+4H^++4e^-}{\rightarrow}{2H_2O}$
${H_2O_2}{\rightarrow}{O_2+2H^++2e^-}$

2.1.3.2 第二代葡萄糖传感器——电子媒介体型

电子媒介体是一种具有良好电化学活性的相对分子质量小的化合物，它担负从酶的氧化还原中心到电极表面传递电子的作用。在催化还原过程中，介体首先与还原性的酶反应，然后扩散到电极表面并进行快速的电子交换。
酶层： $GOD_{ox}+glucose\rightarrow gluconolactone+GOD_{red}$
修饰层： $GOD_{red}+M_{ox}\rightarrow GOD_{ox}+M_{red}$
电极： $M_{red}\rightarrow M_{ox}+ne$

2.1.3.3 第三代葡萄糖传感器——直接电子传递型

直接电化学酶电极摆脱了对中间体的依赖，酶和电极之间牢牢绑定无需任何中间体，酶的氧化还原中心就可以和电极无隔阂的紧密联系在一起。这种方式的结合可以加快电子迁移的速度，加强电信号，提高酶传感器的灵敏性和精度。
$glucose+GO_x(FAD)\rightarrow gluconic+GO_r(FADH_2)$
$GO_r(FADH_2)+O_2\rightarrow GO_x(FAD)+H_2O_2$
$GO_x(FAD)+2e^-+2H^+\rightarrow GO_r(FADH_2)$

第三代酶生物传感器是酶与电极间进行直接电子传递，是生物传感器构造中的理想手段。
这种传感器与氧或其他电子受体无关，无需媒介体，即所谓无媒介体传感器，但由于酶分子的电活性中心深埋在分子的内部，且在电极表面吸附后易发生变形，使得酶与电极间难以进行直接电子转移，因此采用这种方法制作生物传感器有一定难度。

2.2 双抗体夹心ELISA法原理

ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。

3种必要的试剂：

固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）
酶标记的抗原或抗体（标记物）
酶作用的底物（显色剂）

酶结合物（标记物）是酶与抗体或抗原、半抗原在交联剂作用下联结的产物。酶结合物是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用。

酶	底物	显色反应	测定波长
辣根过氧化物酶（HRP）	邻苯二胺四甲基联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺 2,2’-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-AS-Mx磷酸盐+重氮盐)	橘红色黄色棕色兰色蓝绿色	492 460 449 425 642
碱性磷酸脂酶（ALP）	4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐	黄色红色	400 500