用ImageJ打开图片后，

1-1，Image → Type → 8-bit

1-2，Image → Adjust → threshold，弹出Threshold窗口。

1-3，如图，调节这个窗口中间两个横向的滚动条，使图片中的细胞为红色，背景为黑色，其中背景中的红点尽量少而小。其他的不动，然后点apply

如果做完这一步，你的图片中有的细胞的荧光是离散的很多点，而没有连成整片，那么请参考这篇。

1-4，Process → Binary → Fill Holes，这一步是将细胞中间的洞填满

1-5，Process → Binary → Watershed，这一步是把重叠的细胞从中间分割开。如果你的图片里面没有重叠的细胞，可以跳过此步。

1-6，先看步骤1-7。为了估计最小的细胞面积，可以使用魔棒工具选中一个相对较小的细胞，然后Analyze → Measure（或者按M键）计算其面积（弹出的页面中的Area一栏），然后依据其面积估计一个值。这个值可以很小，只要明显比背景的杂点大就行。由于在刚刚的measure中选择了一个细胞，我们随后还需要点击图片窗口，按shift+A取消选择。

1-7，Analyze → Analyze Particles, 弹出Analyze Particle窗口。如图，Size（inch^2）代表筛选细胞面积范围，默认值为“0-Infinity”。为了过滤掉背景中存在一些无关而面积很小的点，这里应该把0改为细胞可能的最小面积（通过1-6进行估计）。其余参数如图所示，尤其注意不要勾选Clear results。点击OK，弹出多个窗口，细胞数就在Summary窗口中。

批量操作多张相似图片

适合对多张相似的细胞图片进行计数。ImageJ将对这些图片进行完全相同的操作。

如果你要处理团状细胞，也就是用第一种方法，那么在批量处理前，你需要提前估计自己所有图片中的细胞面积最小值，估计方法见步骤1-6。

2-1，将需要进行相同操作的图片复制到同一个文件夹。然后用ImageJ打开任意一张图片。

2-2，Plugins → Macros → Record，弹出Recorder窗口。接下来你进行的每一步操作，都会以代码的形式记录在这个窗口。

2-3，按照第一种方法（需跳过步骤1-6）或者第二种方法一步步进行操作。如果出现误操作被记录下来，直接在Recorder窗口中删除对应的代码，再继续操作即可。

2-4，全选Recorder窗口中的所有代码并复制，然后关闭所有窗口（全都不用保存），只留下ImageJ主程序。

2-5，Process → Batch → Macro，弹出Batch Process窗口。Input选择计数图片所在文件夹，Output选择任意一个无用的文件夹即可，ImageJ会将处理过的图片存入Output选中的文件夹。Output Format选择PNG。然后将第4步复制的代码粘贴在最大的框中。注意，如果某行代码最前面有两个斜杠（“//”），则需要把每一行最前面的斜杠都删掉。然后点process，ImageJ就会自动对文件夹中所有图片进行相同的处理，并显示结果。结尾有参考代码。

参考代码：

run("8-bit");
setAutoThreshold("Default");
run("Threshold...");
setThreshold(10, 255);
run("Convert to Mask");
run("Fill Holes");
run("Watershed");
run("Analyze Particles...", "size=0.02-Infinity display exclude include summarize record add in_situ");
roiManager("Show All with labels");
roiManager("Show All");

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