文章目录

1. 构建基因过表达载体
- 1.1 设计 PCR 引物
- 1.2 PCR 扩增目的基因
- 1.3 酶切载体和 PCR 产物
- 1.4 电泳并回收酶切产物
- 1.5 连接
- 1.6 转化
- 1.7 挑选阳性克隆并鉴定
2. 转染
3. 检测过表达效果
附表：常用酶切位点保护碱基

为什么要做基因表达操作？

探寻影响细胞表型变化（增殖、凋亡、焦亡等）相关的分子，了解这些分子之间相互作用的关系（机制）
分子-机制-表型的关系
对谁操作？
① DNA，如 CRISPR-Cas9 对细胞本身的 DNA 删除、添加或替换；最常见的操作如过表达，将外源 DNA 导入细胞，利用细胞的转录翻译系统表达相应的蛋白质。
② 利用具有干扰作用的小 RNA，降解细胞内源 RNA 或抑制翻译，从而影响蛋白质的表达量。

基因过表达操作流程

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1. 构建基因过表达载体

1.1 设计 PCR 引物

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参考：载体构建实例解析——构建 SETD3-pEGFP-N1（Snapgene 设计引物）

（1）寻找 CDS 序列

以 TNF 为例，将 CDS 序列复制到 DNAMAN，保存为 .seq 文件。

（2）分析酶切位点：找出载体多克隆位点 MCS 有，而插入基因中无的酶切位点。

DNAMAN 中载入 TNF 序列文件：Sequence → Load Sequence → From Sequence File → 选择前面保存的 TNF.seq 序列文件。
寻找 TNF 基因中的酶切位点：Restriction → Restriction Analysis → 勾选 Show summary 和 Show sites on sequence → 下一步→Select All → 完成。
关注输出结果中的 Non Cut Enzymes （不会切 TNF 基因的酶切位点），找出载体（以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体为例）多克隆位点 MCS 有，而插入基因中无的酶切位点。
找出切割效率高的酶切位点：切割效率达到 90%以上最好；排除同尾酶，即切割后的粘性末端不能一样（如 XbaⅠ和 NheⅠ是同尾酶）。常用酶切位点表（含保护碱基）
找出在相同 buffer 和温度下工作的酶切位点：
① 利用 NEB 官网的 Double Digest Finder 工具，输入选取的在载体上不相邻 的双酶切位点（如XbalⅠ、BamHⅠ），查看酶的 Buffer、反应温度 及相应的 酶切效率。
如图，BamHⅠ标记了星号，表示该酶在相应 buffer 中有星号活性（非特异性酶切活性），酶会乱切，把 DNA 切断，因此要避免有星号活性的酶，此处 BamHⅠ不可选。

② 但在输入 BamHⅠ时提示还有 BamHⅠ-HF， HF 代表是改造过的切割效率比较高的酶，选择 BamHⅠ-HF 后结果如下图，XbalⅠ和BamHⅠ-HF都能在 37℃ rCutSmart Buffer 中达到 100%的酶切效率，可选。
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（3）添加保护碱基和 Kozak 序列

在酶切位点外侧添加保护碱基，可以给外切酶提供支撑点，提高酶切效率。如：XbalⅠ和BamHⅠ-HF保护碱基分别是 GC 和 CG
Kozak 序列（GCCACC AUG G）是真核生物 5’帽子结构后面的一段核酸序列，可以与翻译起始因子结合，介导含有 5’帽子结构的 mRNA 的翻译起始。对应原核生物的 SD 序列。核糖体可以识别这段序列，并且作为翻译起始位点。
注意：下游引物是按规则框架设计好的引物的 反向互补序列。

（4）验证引物是否适合 PCR： （不适合也没办法，载体引物的局限性），只看与目的基因互补配对的部分（目的基因 CDS 序列），引物 Tm 值也只计算与目的基因完全互补配对的部分。

参考：载体构建实例解析——构建 SETD3-pEGFP-N1（Snapgene 设计引物）

1.2 PCR 扩增目的基因

参考：【实验技术笔记】RNA 抽提 + 反转录 PCR + PCR 引物设计 + RT-qPCR
与做 RT-PCR 一样，只是酶不同。
推荐：高保真酶 TOYOBO KOD-Plus-Neo（KOD-401） 便宜大碗，性能不错。
Agilent PfuUltra II Fusion HS DNA Polymeras（600670） 稍贵，性能强。
反应液配制：配完后，可额外加 0.5 μl ExTaq，加 ExTaq 的 PCR 产物尾巴带突出的 A 碱基，方便做 TA 克隆。
PCR 程序：克隆 PCR 建议用 Touchdown PCR 程序设置。在普通 PCR 前加 10 个循环的 Touchdown 程序，一般从 68℃降到 58℃（如果还 P 不出来，可以从 72℃开始降到 58 或 55℃）。

1.3 酶切载体和 PCR 产物

酶切体系：分 2 管，一管切载体，一管切 PCR 产物。内切酶各 1ul，10×buffer 2ul，37 ℃ 酶切 2h 后跑胶回收。
推荐： NEB的酶，选择多，高效的酶多。

1.4 电泳并回收酶切产物

1、1%琼脂糖凝胶电泳后分别割胶回收载体片段和目的基因片段，0.5cm 胶块+300μl 熔胶液，55-60℃ 加热熔胶。
2、上柱，离心 5000g×5min 过柱。
3、700ul wash buffer，最大速离心 1min 洗柱 2 次，最大速离心 2min。
4、50ul ddH₂O（最好加热到 50-60℃），最大速离心 2min 洗脱（建议洗脱 2 次，把第一次洗脱的液体吸到柱子里再离心一次，提高产率），Nanodrop 测浓度。
推荐：胶回收试剂盒，OMEGA，Gel Extraction Kit（D2500-01） 不推荐国产的如天根、生工（效率较差）。

1.5 连接

用 T4 DNA Ligase 把 PCR 产物酶切回收片段 (insert) 和载体酶切回收片段 (vector) 连接在一起，16℃连接 4h 或过夜。（连接温度以 16℃为佳，但是 16℃的连接温度没有金属浴不好办，还是 4℃
过夜（12-16h）比较方便，其实室温下几个小时也是可以的。）
连接体系：

◆ 载体酶切回收片段加到 100ng 以上，加少了连接产物可能比较少；
◆ 连接体系按连接酶说明书配制（通常 10μl 连接体系中 T4 DNA 连接酶加 1μl，10×buffer 加 1μl）
◆ 酶切载体片段与目的片段的摩尔比例，建议以 1:5-1:10 之间比较合适，可使用 克隆构建摩尔比计算工具 进行计算每 μl 酶切载体片段需要加多少 μl 目的片段，将 ABCD 4 个位置的示例数据替换成你的实验数据，即可自动计算出不同比例下每 μl 酶切载体片段需要加多少 μl 目的片段。（可以 vector 加 100ng，然后剩下的体系全部加 insert，不加水？）
推荐：NEB，T4 DNALigase（M0202）

1.6 转化

1、从-80℃冰箱中取出感受态细胞（ Top10 感受态或 DH5α 感受态等），置于冰盒上解冻，并做好标记；
2、连接产物 10 μl，加入到 20μl 感受态中；（天根的感受态细胞一支 100ul，可以不按说明书全用掉，可以分装成 20ul 来用，后面加新鲜 LB 时也按比例缩小）
3、混匀后冰浴 30min；
4、42 ℃ 热激 1min30s；（此步可换成室温静置 5-15min，一般冬天静置 15min，夏天 5min，效率几乎相同）；
5、冰浴 3-5min；（省略此步，依旧实验顺畅，但是建议加上，感觉对效率还是有一定影响的）；
6、加 100ul 新鲜无抗生素 LB 培养基，37 ℃ 200rpm 摇床上复苏 1h；
7、铺板：涂布含抗生素的 LB 平板，37℃倒置培养 16h。（在生物安全柜中，将摇菌完成的产物加入到 LB 平板中，尽量加在中间，不要加在边上，用涂布棒涂布均匀；37℃正置培养 1h，待液体稍干后倒置培养 12-16h）
推荐：TIANGEN，TOP10 感受态细胞（CB104） 天根的都可以
LB 培养基配方：
LB 平板制备：
① 配 LB 琼脂：有配方，但是建议直接买预混好的，按说明书配，如百思的 BS1080。融解过程需要适当加热，最好用可加温的磁力搅拌器，一般 65℃即可完全融解。
② 融解完全后，倒入干净的容器（如高压过的丝口瓶），高温高压灭菌。
◆ LB 培养基高压之后会有少许沉淀，属正常现象，摇菌过程中会自行溶解。如果不溶解，则要怀疑是不是培养基污染。建议摇菌前将培养基摇匀后再添加到摇菌管、离心管或三角瓶中。
③ 高压后的 LB 琼脂，冷却到 50℃左右，加入相应的抗生素，如卡那霉素，氨苄青霉素等，混匀。若是已经冷却完全的 LB 琼脂，建议使用微波炉，开小火，每次加热 1min，直到完全融化为止。
④ 取无菌的细菌培养皿，趁热将加抗生素的 LB 琼脂倒入培养皿，一般 90mm 皿倒 10ml（二分格的皿，一边倒 5ml，不好把握时，可用移液器）。
⑤ 倒入 LB 琼脂的板子，放平，冷却，待 LB 琼脂凝固，保鲜膜包裹，存放 4℃。

1.7 挑选阳性克隆并鉴定

1、挑阳性克隆摇菌：用无菌枪头挑阳性克隆到含 1‰ 抗生素的 LB 培养基（大肠杆菌）中，37℃ 200rpm 摇床上培养过夜（10-12h，不要超过 16h，时间过长，菌长老了提取效果就不好。当然如果给的培养基量大，可以适当延长摇菌时间。）；
2、菌落鉴定：
◆ 方法一：酶切鉴定：摇好的菌液抽提质粒（小抽），做酶切、电泳，看目的片段有没有插入载体中（先摇菌，再提质粒，酶切完跑胶鉴定，好麻烦。而且很费钱呀，限制性内切酶、质粒小提的盒子，都不便宜。因此不建议在单纯需要菌落鉴定时使用。）；
◆ 方法二：直接做菌液 PCR，吸 1ul 摇好的菌液，PCR 的酶可以用做 RT-PCR 的 2×Mix，PCR 引物直接用做克隆构建用的 PCR 引物，电泳看是否有目的条带。
△ 菌液 PCR 就是利用菌体高温裂解释放出的 DNA 为模板进行的 PCR 反应，菌液 PCR 需要先挑菌落于 1ml 含抗生素 LB 中，摇菌 1-2h，然后取 0.5μl 加入到 PCR 体系中，然后上机。
△ 第一天下午质粒转化后铺板，第二天早上挑菌落，进行菌液 PCR 检测，电泳完看到结果基本上快中午了。如果此时直接把 PCR 阳性的菌落/菌液拿去摇菌，时间安排就很难受，摇 10h 是晚上，摇 16h 是半夜。所以可以将菌液 PCR 这前摇了 2 小时的菌液放到 4℃，待晚上离开实验室前，再加 LB 培养基摇菌，第二天早上来提质粒。
△ 菌液 PCR 体系：

△ PCR 程序：
95℃ 15min，时间短的话，可能解链不完全
95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，25 个循环
72℃ 7min，暂存 4℃或电泳
3、测序：有条件的实验室可以自己测，没有条件的话，就送公司检测，费用不贵，每个反应十几元，每个反应能测约 700bp。这也是前面设计引物时控制 PCR 产物长度在 200-500 的重要原因之一。
质粒构建完成，送测序，推荐直接送菌液测序，公司提取后检测。自己提取质粒然后送测序，有可能会测不出来。若要自己提，推荐 OMEGA 质粒小提盒，无内毒素为佳。测序结果与目标序列对比，正确则为构建成功。
4、测序后抽提重组质粒（大抽），按试剂盒说明书提取，用于后续步骤。
推荐：OMEGA，E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Mini Kit（D6948-01）

2. 转染

脂质体转染

参考：什么是脂质体？脂质体转染的原理和步骤？
1、提前铺细胞，使转染时密度达到 80%左右。密度太低细胞容易死，太高影响转染效率；
2、使用 OPTI-MEM 分别稀释 lipofectmine 2000（脂质体载体，转染试剂）和 重组质粒（没有内毒素的）后轻轻混匀（脂质体不耐吹打），室温孵育 5min 后逐滴加入提前铺好的待转染细胞中。
推荐：Lifetechnology，Lipofectamine 2000 Reagent（11668） 质粒比较大或细胞难转染，可以用 Lipofectamine 3000。

慢病毒包装（以 PLKO.1-PURO 体系为例）

● (1) 材料：psPAX2（无内毒素），pMD2.G（无内毒素），测序正确的带有插入片段的 PLKO.1-PURO（无内毒素），HEK-293T cells，OPTI-MEM® serum-free media，转染试剂 lipofectmin 2000。

● (2) 步骤（以 60mm 圆皿为例）：

a) 转染前一天，在 60mm 圆皿中接种 HEK-293T 细胞，37℃，5% CO₂ 培养过夜。注意接种时调整接种密度，使转染时细胞融合约 50-80%。如果养细胞时加了双抗，此时要去掉抗生素。
b) 转染当天：（尽量下午或晚上转染）
△ 预混质粒，三个质粒的比例是可以优化的。
△ 预混 LIPO2000：LIPO2000 20μl 加 OPTI-MEM 至 500μl。
△ 两者混合，室温静置 5min，将混合液缓慢分散加入培养皿中，37℃，5% CO₂ 继续培养。
c) 转染次日：转染 8-12h 后更换完全培养基，可恢复双抗，37℃，5% CO₂ 培养 24h。
d) 转染第二日：收集培养基上清，即可得到慢病毒颗粒，1200rpm 离心 5min，去除混杂的 293T 细胞，存-80℃。
e) 转染第三日：再次收集培养基上清，也可得到慢病毒颗粒，1200rpm 离心 5min，去除混杂的 293T 细胞，存-80℃。
f) 病毒滴度测定及 MOI 测定：采用有限稀释法，建议参考吉凯、吉玛、汉恒公司慢病毒使用手册。