对MECAT2感兴趣的话，或者在MECAT2使用时遇到了什么问题，可以加'MECAT和NECAT问题解决群', 群号是:316859622

NECAT是肖传乐老师团队开发的一个针对Nanopore数据组装的软件，目前该工具尚未发表，除了https://github.com/xiaochuanle/NECAT有软件的介绍外，暂时没有中文资料介绍NECAT的使用。

太长不看的结论: Nanopore的组装推荐用下NECAT。组装之后是先用MEDAKA做一遍三代polish，然后用NextPolish默认参数做二代polish。

这篇将会以一篇发表在Nature Communication上的拟南芥nanopore数据介绍如何使用NECAT进行组装，运行在CentOS Linux release 7.3.1611 (Core)，64G为内存， 20线程(Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2640 v4 @ 2.40GHz)，下面是正文。

软件安装

NECAT可以在https://github.com/xiaochuanle/NECAT/releases/页面获取最新的软件下载地址，这里下载的是0.01版本。

wget https://github.com/xiaochuanle/NECAT/releases/download/v0.01/necat_20190307_linux_amd64.tar.gz

tar xzvf necat_20190307_linux_amd64.tar.gz

export PATH=$PATH:$(pwd)/NECAT/Linux-amd64/bin目前0.01版本不支持gz文件作为输入，但后续版本应该会支持。

实战

第一步: 新建一个分析项目mkdir NECAT&&cd NECAT

以发表在NC上的拟南芥数据为例, 下载该数据

# 三代测序

wget ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/ERR217/003/ERR2173373/ERR2173373.fastq.gz

seqkit seqkit fq2fa ERR2173373.fastq.gz|gzip-c>ERR2173373.fasta

第二步: 创建配置文件necat.pl config ath_config.txt

配置文件中，主要修改如下几个参数

PROJECT=athaliana#项目名

ONT_READ_LIST=read_list.txt#read所在路径文件

GENOME_SIZE=120000000#基因组大小

THREADS=20# 线程数

MIN_READ_LENGTH=3000# 最短的read长度

CNS_OUTPUT_COVERAGE=45# 用于组装的深度

参数中还有一个，NUM_ITER=2，它并非是简单的重复2次纠错，它的每一轮的校正目的其实不同，第一轮的优先级是敏感度(senstitive)， 第二轮之后主要追求速度(fast)。

除了上面的配置参数外，其他参数可以不需要修改，使用默认的值即可。需要修改的话，参考最后的参数说明部分。

第三步: 序列纠错necat.pl correct ath_config.txt&

纠错后的reads在 athaliana/1-consensus/cns_final.fasta

cns_finla.fasta的统计信息会输出在屏幕中， 或者自己用 fsa_rd_stat也能得到同样的结果

Count:206342

Tatal:3102480870

Max:112992

Min:1010

N25:31940

L25:18989

N50:21879

L50:48506

N75:13444

L75:93215

此外我还用time获取了运行时间，纠错花了大概一个小时。real55m31.451s

user815m32.801s

sys7m55.039s

第四步: contig组装

necat.pl assemble ath_config.txt&

结果在 athaliana/4-fsa/contigs.fasta

关于 contigs.fata统计信息会输出在屏幕上，同样用 fsa_rd_stat 也可以。Count:162

Tatal:122293198

Max:14562810

Min:1214

N25:13052494

L25:3

N50:9503368

L50:5

N75:4919866

L75:10

时间用了75分钟

real74m53.127s

user1308m29.534s

sys12m5.032s

第五步: contig搭桥necat.pl bridge ath_config.txt

结果在 athaliana/6-bridge_contigs/bridged_contigs.fasta

Count:127

Tatal:121978724

Max:14562810

Min:2217

N25:13193939

L25:3

N50:11146374

L50:5

N75:5690371

L75:9

从N50和N75可以看出这一步会提高组装的连续性。

组装结果polish

对Nanopore组装结果进行polish的常用软件有下面3个Medaka

nanopolish

racon

由于拟南芥的基因组比较小，我分别用了Medaka和racon对输出结果进行polish(因为没有原始信号数据，因此nanopolish用不了)，代码如下

MedakaNPROC=20

BASECALLS=ERR2173373.fasta

DRAFT=athaliana/6-bridge_contigs/bridged_contigs.fasta

OUTDIR=medaka_consensus

medaka_consensus-i ${BASECALLS}-d ${DRAFT}-o ${OUTDIR}-t ${NPROC}-m r941_min_high

三轮Racon:

gzip-dc ERR2173373.fastq.gz>ERR2173373.fastq

minimap2-t20${DRAFT}ERR2173373.fastq>round_1.paf

racon-t20ERR2173373.fastq round_1.paf ${DRAFT}>racon_round1.fasta

minimap2-t20racon_round1.fasta ERR2173373.fastq>round_2.paf

racon-t20ERR2173373.fastq round_2.paf racon_round1.fasta>racon_round2.fasta

minimap2-t20racon_round2.fasta ERR2173373.fastq>round_3.paf

racon-t20ERR2173373.fastq round_3.paf racon_round2.fasta>racon_round3.fasta

在后续评估质量的时候，我发现单纯用三代polish的结果还不是很好，因此我用他们提供的二代测序，用NextPolish对NECAT的结果进行polish。# 二代测序

prefetch ERR2173372

fasterq-dump-O.ERR2173372

run.cfg内容如下, 其中sgs.fofn记录的就是解压后的ERR21733721.fastq和ERR21733722.fastq的路径

[General]

job_type=local

job_prefix=nextPolish

task=1212

rewrite=no

rerun=3

parallel_jobs=8

multithread_jobs=20

genome=input.fasta

genome_size=auto

workdir=./nextpolish

polish_options=-p{multithread_jobs}

[sgs_option]

sgs_fofn=./sgs.fofn

sgs_options=-max_depth100-bwa

我考虑了两种情况，一种是直接用二代polish，另一种是三代polish之后接二代polish。

结果评估

在计算时间上，我之前用Canu跑了相同的数据，设置原始错误率0.5，纠错后错误率为0.144，用3个节点(每个节点12个线程)，运行了3天时间，但是NECAT只需要3个小时左右就能完成相同的分析，这个速度差异实在是太明显了。

用Minimap2 + dotPlotly绘制CANU，NECAT和拟南芥参考基因组的共线性图minimap2-t20-x asm5Athaliana.fa NECAT.fa>NECAT.paf

pafCoordsDotPlotly.R-i NECAT.paf-o NECAT-l-p10-k5

minimap2-t20-x asm5Athaliana.fa CANU.fa>CANU.paf

pafCoordsDotPlotly.R-i CANU.paf-o CANU-l-p10-k5

NECAT的结果

CANU的结果

NECAT和CANU都和参考基因组有着良好的共线性，但是NECAT的连续性更好，几乎成一条直线。

之后，我使用了QUAST来评估Canu，NECAT初步组装，NECAT用Medaka， nanopolish和racon纠错的结果(MD: MEDAKA, RC: RACON, NP:NextPolish)。

quast.py-t100--output-dir athaliana--circos \

CANU.fa \

NECAT.fa \

NECAT_MD.fa \

NECAT_MD_NP.fa \

NECAT_NP.fa \

NECAT_RC.fa \

NECAT_RC_NP.fa \

-rAthaliana.fa \

-g TAIR10_GFF3_genes.gff&

一些描述基本信息CANU N50=4875070,L50=7,Totallength=114689024,GC%=36.09

NECAT N50=11146374,L50=5,Totallength=121978724,GC%=36.50

NECAT_MD N50=11216803,L50=5,Totallength=122101599,GC%=36.54

NECAT_MD_NP N50=11405151,L50=5,Totallength=124142955,GC%=36.30

NECAT_NP N50=11399084,L50=5,Totallength=124735066,GC%=36.36

NECAT_RC N50=11212098,L50=5,Totallength=122519370,GC%=36.4

NECAT_RC_NP N50=11406553,L50=5,Totallength=124618502,GC%=36.34

在BUSCO完整度上， 以embryophytaodb10作为物种数据库, 其中ONTminIT4是发表的文章里的结果, Athalina则是拟南芥的参考基因组，我们以它们的BUSCO值作为参照。

Athalina:C:98.6%[S:98.0%,D:0.6%],F:0.4%,M:1.0%,n:1375

ONTmin_IT4:C:98.4%[S:97.7%,D:0.7%],F:0.7%,M:0.9%,n:1375

CANU:C:22.9%[S:22.8%,D:0.1%],F:20.2%,M:56.9%,n:1375

NECAT:C:36.6%[S:36.6%,D:0.0%],F:22.9%,M:40.5%,n:1375

NECAT_MEDAKA:C:53.6%[S:53.2%,D:0.4%],F:21.0%,M:25.4%,n:1375

NECAT_RACON:C:45.3%[S:45.2%,D:0.1%],F:23.1%,M:31.6%,n:1375

二代Polish后的BUSCO结果如下(MD: MEDAKA, RC: RACON, NP:NextPolish)：Athalina:C:98.6%[S:98.0%,D:0.6%],F:0.4%,M:1.0%,n:1375

ONTmin_IT4:C:98.4%[S:97.7%,D:0.7%],F:0.7%,M:0.9%,n:1375

NECAT_NP:C:98.6%[S:97.9%,D:0.7%],F:0.4%,M:1.0%,n:1375

NECAT_MD_NP:C:98.7%[S:98.0%,D:0.7%],F:0.4%,M:0.9%,n:1375

NECAT_RC_NP:C:98.5%[S:97.8%,D:0.7%],F:0.4%,M:1.1%,n:1375

从以上这些数据，你可以得到以下几个洞见:在Nanopore的组装上，NECAT效果优于Canu，无论是连续性还是N50上

MEDAKA三代polish效果好于RACON。在速度上，MEDAKA比三遍RACON都慢，并且MEDAKA会将一些可能的错误组装给打断

Nanopore的数据用NECAT组装后似乎用NextPolish进行polish后就行，但是由于物种比较小，可能不具有代表性。

结论: Nanopore的组装建议用NECAT。组装之后是先用MEDAKA做一遍三代polish，然后用NextPolish默认参数做二代polish。

配置文件补充

这部分对配置文件做一点简单补充。

下面这些参数相对简单，不需要过多解释，按照自己需求修改CLEANUP: 运行完是否清理临时文件，默认是0，表示不清理

USE_GRID: 是否使用多节点, 默认是false

GRIDNODE: 使用多少个节点，默认是0，当USEGRID为true时，按照自己实际情况设置

以下的参数则是需要根据到具体的软件中去查看具体含义，需要和软件开发者讨论OVLPFASTOPTIONS: 第二轮纠错时, 传给 c2pmov

OVLPSENSITIVEOPTIONS: 第一轮纠错时, 传给 c2pmov

CNSFASTOPTIONS: 第二轮纠错时，传给 oc2cns

CNSSENSITIVEOPTIONS: 第一轮纠错时，传给 oc2cns

TRIMOVLPOPTIONS: 传给 oc2asmpm

ASMOVLPOPTIONS: 传给 oc2asmpm

FSAOLFILTER_OPTIONS: 参数传给 fsa_ol_filter

FSAASSEMBLEOPTIONS: 参数传给 fsa_assemble

FSACTGBRIDGE_OPTIONS: 参数传给 fsa_ctg_bridge

参考资料https://github.com/xiaochuanle/NECAT