Org. Biomol. Chem.|通过组合生物合成产生新的类似物的抗真菌费尔南型三萜多聚类素的生物合成表征
今天为大家介绍的是来自Xin-Yu Li、Jian-Ming Lv和Zhi-Qin Cao团队的一篇论文。费尔南型三萜是植物和真菌中的一类具有广泛生物活性的天然产物，其中真菌来源的Polytolypin展现出强抗真菌活性。然而，真菌衍生的费尔南型三萜的生物合成机制一直未被表征，限制了其结构多样性的拓展。研究团队成功鉴定了多酚类蛋白的生物合成基因簇，并在米曲霉NSAR1中通过异源表达阐明了其生物合成途径，该途径涉及一种新的三萜环化酶及后续三种P450酶的多次氧化。此外，还发现了两种新的三萜环化酶，它们能合成异烟叶醇和费尔南醇这两种费尔南类骨架，并与多酚类生物合成中的P450酶共表达。这些研究共合成了13个费尔南型三萜，包括8个新化合物，其中2个对白色念珠菌FIM709的抗真菌活性超过Polytolypin。
导论
三萜是一大类天然产物，通常源自角鲨烯或氧化角鲨烯，近期也发现了由二磷酸六戊烯基合成的非角鲨烯类三萜。三萜具有广泛的生物活性，是药物发现的重要资源。费南德型三萜是植物和真菌中的一类特定萜类化合物，其生物合成一般从角鲨烯或氧化角鲨烯开始，经过环化及后续修饰形成。在真菌中，费南德型三萜主要分为两类，其中I组具有完整的五环骨架和高氧a环，且展现出有效的抗真菌活性，但目前已知的I族费尔南型三萜仅有两种。
鉴于费南德型三萜的药用价值，研究团队利用基因组数据、合成生物学工具和异源寄主的发展，采用了基于个体生物合成途径功能表征的组合生物合成策略，以扩大天然产物的结构多样性。在此基础上，团队从产生者中鉴定了polytolypin的生物合成基因簇，并表征了其生物合成途径。这一途径涉及一种新型的费尔南型三萜环化酶，负责运动醇的生物合成，随后经三种细胞色素P450氧化生成polytolypin。此外，这三种P450酶还与另外两种新的真菌费尔南型环化酶联合，用于异烟叶醇和茴香醇的生物合成，生成了六种polytolypin类似物。
通过异源表达多酚类蛋白的生物合成基因簇和组合生物合成，研究团队共获得了13个化合物，其中8个为新化合物。体外抗真菌实验表明，其中两种新的类似物对白色念珠菌FIM709的抗真菌活性强于polytolypin。
图1
结果与讨论
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polypolyypin生物合成基因簇的鉴定
图2
直到2018年，真菌费尔南型三萜环化酶才被首次报道，当时发现了一个嵌合三萜环化酶EfA，它包含萜烯环化酶结构域和糖基转移酶结构域，并证明其参与了enfumafungin的形成，但具体功能尚待阐明。研究团队使用EfA的萜类环化酶结构域氨基酸序列作为查询序列，在NCBI数据库中对多肽类产生菌株P.hystricis UAMH7299的基因组数据进行了BLAST搜索。结果发现了一个候选三萜环化酶PoIA，其与EfA的相似度为62%。通过构建系统发育树，研究团队发现PoIA与hopane-3β，22-二醇环化酶AfumA以及EfA的萜类环化酶结构域属于同一分支，而与四环三萜环化酶不在同一分支。进一步对PoIA邻域序列进行硅分析，发现其下游存在4个细胞色素P450基因polB至polE。因此，研究团队提出，这5个基因（polA至polE）组成的基因簇负责多聚色素的生物合成。
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polytolypin生物合成途径的表征
图3
为了阐明polytolypin的生物合成途径，研究团队首先将环化酶基因poIA引入四重营养不良宿主A.oryzae NSAR1中，得到转化体AO-PoIA。通过HPLC-MS分析，发现AO-PoIA产生了额外的产物motiol，表明PolA负责生物合成费尔南型骨架motiol。PolA是首个被表征的真菌费尔南型三萜环化酶，专门用于构建运动醇骨架。
接下来，研究团队将四个P450基因单独引入AO-PoIA中，以分析它们的功能。发现PoIB、PolD和PoIE不能接受运动醇作为底物，而PolC可以将motiol中的4a-甲基转化为羧基，生成产物3。进一步的功能分析显示，PoIB负责在3的2a位置附加一个羟基，生成产物4；而PolE是一个双功能P450，可以催化1β-羟基和10β-羧基的形成，生成polytolypin的2-脱氧衍生物5。由于未检测到其他中间体，PolE的氧化顺序尚不确定。
最后，研究团队在A.oryzae NSAR1中共表达polA、poIB、polC和polE，成功产生了与polytolypin相同分子量的产物，并通过NMR数据和旋光度分析证实了其结构。同时，构建包含所有5个基因的转化体AO-PoIA/B/C/DE，结果只能产生polytolypin，没有其他可观察到的附加产物，进一步证实了PoID不参与polytolypin的生物合成。
在此基础上，研究团队阐明了聚多角鲨素的生物合成途径：三萜环化酶PolA首先催化2,3-氧化角鲨烯环化为运动醇，然后由细胞色素P450 PolC转化为含有羧基的产物3；随后，3被PolB介导的2a羟基化生成产物4；最后，PoIE的八电子氧化将4转化为polytolypin。此外，PoIE也可以直接修饰产物3，得到的产物5再被PolB羟基化得到polytolypin。
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Ⅱ族费尔南型三萜的组合生物合成
图4
研究团队基于三种真菌fernene型骨架在结构上的高度相似性，推测异烟叶醇和fernenol可能被Po1B/C/E所接受。为了增加I族茴香型三萜的结构多样性，他们计划将PoIB/CE与异肌醇和茴香醇环化酶进行组合生物合成。
首先，研究团队验证了嵌合三萜合成酶EfA的功能。原本预期EfA负责糖基化异烟叶醇的形成，但在A.oryzae NSAR1中的异源表达结果显示，EfAm实际上负责产生fernenol，而非isomotiol。同时，他们确定了一个候选基因fsoA，编码萜烯环化酶结构域和糖基转移酶结构域，并证实截断的蛋白FsoA-负责异烟醇的生物合成。
接着，研究团队研究了PoIB/CE与EfuA-的兼容性。通过共表达实验，他们成功获得了与已知产物具有相同分子量的新产物，并进一步证实了其结构特征。类似地，他们还研究了PoIB/C对FsoA-产生的异烟叶醇的混杂性，发现异烟叶醇也可以被PolC氧化，并进行后续的羟基化反应。然而，当引入PolE时，相关产物消失，推测可能是被转化为其他无法检测到的产物。
综上所述，PoIB/C/E对三种fernene型骨架具有较宽的底物耐受性。通过组合生物合成策略，研究团队共获得了5种新的多聚类蛋白类似物。他们表明，将多种费尔南型三萜的环化酶与来自单个费尔南型三萜生物合成途径的剪裁酶结合，可以为生成多种费尔南型三萜提供新途径。此外，研究团队还提出了随机组合策略，通过将不同生物合成途径的剪裁酶与共同中间体的核心酶随机组装，以进一步扩展费尔南型三萜的化学多样性。
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1-13抗真菌活性评价
表1
研究团队对化合物1-13进行了针对白色念珠菌FIM709和黑曲霉R330的抗真菌试验。结果显示，化合物1、5和11对黑曲霉R330的抑菌活性较弱。然而，化合物1、5、10和11对白色念珠菌FIM709展现出较好的生长抑制作用，其最小抑制浓度分别为31.25、15.63、15.63和31.25 μmL^-1。通过构效关系分析，研究团队发现，C-1和C-25位置的多氧化有助于增强抗真菌活性，而2a-OH基团的引入（由polB催化）则对活性不利。这一发现再次证明了生物合成中间体有时比最终产物具有更高的生物活性。此外，研究还表明，费尔南骨架中的双键位置（Δ’和Δ）对生物活性无显著影响。
讨论
在这项研究中，研究团队成功鉴定了抗真菌的费尔南型三萜多酚素的生物合成基因簇，并利用A.oryzae NSAR1作为异源表达宿主，对多酚类蛋白的生物合成过程进行了深入表征。研究发现，真菌fane型环化酶——运动醇环化酶POIA，与三种P450酶PoIB/CE共同参与了多酚类蛋白的生物合成。为了拓展聚多酚类类似物的种类，研究团队在真菌中鉴定了两种新的菲南型环化酶，并将这两种环化酶分别与A.oryzae NSAR1中的PoIB/CE组合，成功获得了5种新的聚多酚类类似物。后续的抗真菌实验显示，化合物1、5、10和11对白色假丝酵母菌FIM709具有显著的抑制活性，值得注意的是，中间体5和10的活性甚至强于最终产物多聚素。
参考文献
1.I.Abe, Nat. Prod. Rep.,2007,24,1311-1331.
2.H. Tao, L. Lauterbach, G. Bian, R. chen, A. Hou, T. MoriS. cheng,B Hu,L.u,X.Mu,M.i,N.Adachi.M. Kawasaki, T. Moriya, T. Senda, X. Wang, Z. Deng, I. Abe.J.S. Dickschat and T. Liu, Nature, 2022,606, 414-419.
原文链接：
https://doi.org/10.1039/D2OB02158G
