2023年6月23日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所张兴坦研究团队在Horticulture Research上发表题为“5mC DNA methylation modification-mediated regulation in tissue functional differentiation and important flavor substance synthesis of tea plant (Camellia sinensis L.)”的研究论文。研究整合了5mC DNA甲基化组、转录组和代谢组学的数据分析，揭示了5mC DNA甲基化在调控茶树根中茶氨酸生物合成及茶叶加工过程中风味代谢物变化的分子作用机制。

01  研究背景 

在植物中，5mC DNA甲基化是一个重要且保守的上位性标记，涉及基因组稳定性、基因转录调控、发育调控、非生物胁迫反应和代谢产物合成等。然而，5mC DNA甲基化修饰在茶树生长发育、采前及采后加工中风味物质合成中的作用尚不清楚。

02   研究材料

'铁观音'在采前的根、果、叶、花，采后加工过程的萎凋叶和翻叶。

03   研究路线 

04   研究结果 

1、5mC在茶树采前组织的功能分化中起重要调节作用

研究首先对'铁观音'在采前的4种代表性组织(根、叶、花、果)进行了全基因组5mC甲基化和转录组分析。根据甲基化水平相关性分析(图1A)的结果显示，同一组织的三个生物学重复倾向于聚集在一起，不同的组织可以被清楚地区分，代表数据的可靠性。叶片中3种模式的5mC甲基化水平在所有组织中都是最低的，而果实中的是最高的；尤其是叶片中的CHH甲基化水平远低于其他组织，且所有组织的CHH甲基化水平差异较大(图1B)。这意味着不同组织具有不同的5mC甲基化状态。

为了研究5mC甲基化对采前组织特异性基因表达的影响，根据TAU值(≥0.8)将所有基因分为组织特异性表达的和非组织特异性表达的，在叶、花、果实和根中分别鉴定了总共1902、437、756和2093个组织特异性表达的基因(图1C)。与组织特异性表达的基因相比，非组织特异性表达的基因在基因体区显示出较高水平的CG、CHG和CHH 5mC甲基化，在基因启动子区具有较高水平的CG和CHG 5mC甲基化，但在基因启动子区具有较低水平的CHH 5mC甲基化(图1D)。此外，以根作为测试样本，根中特异性低甲基化的387个基因，KEGG注释显示它们确实与根特异性生物活性密切相关，例如对水的响应和含氮物质的运输(图1E)。这些结果表明，组织间不同的5mC甲基化参与调节组织特异性基因表达。

图1. 5mC甲基化水平在茶树采前的四个关键组织中不同

2、5mC甲基化参与调节茶树根部主要茶氨酸的合成和对非生物胁迫的响应

先前的研究表明，茶树中重要的口感物质茶氨酸主要在根部合成，但其在根中特异性合成的上位性调控机制不明。此研究在根中特异性低甲基化的387个基因中鉴定了负责茶氨酸合成的两个关键基因(CsAlaDC和TS/GS)(图2A)，它们在根中相对于其他组织具有较低的5mC甲基化水平和较高的表达水平(图2B-D)，部分解释了它们在根主导的茶氨酸合成中的功能。这一结果为茶氨酸的组织特异性合成模式提供了上位调控见解。

此外，将每个组织中具有最高5mC甲基化水平的前2000个基因和具有最低5mC甲基化水平的前2000个基因进行Venn分析，获得了612个保守的CG高甲基化基因、1152个保守的CHG高甲基化基因、1110个保守的CHH高甲基化基因、1329个保守的CG低甲基化基因、1344个保守的CHG低甲基化基因和364个保守的CHH低甲基化基因。GO注释结果显示，CG和CHG型保守的高/低甲基化基因及CHH保守的低甲基化基因被注释为基本生命活动相关途径，而保守的CHH高甲基化基因与非生物胁迫刺激、化学物质反应和细胞稳态相关(图2E)。作者推测，胁迫相关基因在正常环境下的高CHH 5mC甲基化状态可能是植物节能的一种机制，而这些基因在胁迫刺激下5mC甲基化水平的快速降低可以引起基因表达水平的上调以适应胁迫环境。

图2. 5mC甲基化参与调控茶树根系茶氨酸合成和对非生物胁迫的响应

3、压力驱动下乌龙茶采后加工过程中代谢物的变化

茶叶在加工过程中会形成独特的风味和品质。为了解释这一现象，作者首先对三种加工叶(茶叶、萎凋叶和翻叶)进行了代谢组学分析。使用UPLC-MS/MS(1147种非挥发性代谢物)和GC-MS(230种挥发性代谢物)共获得1377种代谢物，其中黄酮类化合物所占比例最大，其次是酚酸类、脂类、萜类、氨基酸及其衍生物、有机酸和生物碱(图3A)。相关性分析表明，翻叶与茶叶和萎凋叶的相关性较差，尤其是挥发性物质(图3B和C)，表明茶叶在翻叶过程中挥发性物质的含量变化剧烈。

代谢物含量和比例的变化会影响茶的风味。在茶叶加工过程中，由于挥发性和非挥发性代谢物的同时增加(图3E)，使得总代谢物含量趋于增加(图3D)，特别是在翻转过程后挥发性物质增加了2倍。对茶叶香气有贡献的脂类和萜类物质含量在翻转后显著增加，表明在翻转过程中多重胁迫驱动的代谢产物变化对增强茶叶香气有重要意义(图3E)。重要的是，整个加工过程促进了许多新的次生代谢产物的不断产生(图3F)，这些新出现的代谢产物促成了茶叶、萎凋叶和翻晒叶之间的相关性差异。

图3. 乌龙茶采后加工过程中代谢物的变化

4、乌龙茶采后加工中差异代谢产物和差异表达基因的鉴定

与茶叶相比，萎凋和翻转后，大多数代谢物的含量显著上调，只有少数代谢物的含量下降(图4A)。在三个成对差异组合中，获得了127、407和343个差异代谢物(DMs)，其中55个是三个差异组合共有的，这意味着这55个代谢物在加工过程中经历了剧烈的变化。基于含量变化，将所有DMs分为三个亚类(图4B)。亚类1突出了萎凋后含量显著增加的代谢物，包括酚酸、脂质、核苷酸和衍生物、酯以及氨基酸和衍生物(图4C)。翻转后，脂类、萜类酚酸、酯类、氨基酸及其衍生物、生物碱等代谢产物显著增加，而大量黄酮类化合物和一些与茶叶苦味、涩味有关的酚酸含量在整个加工过程中呈下降趋势(图4C)。特别的，13种与香气密切相关的代谢物在翻转阶段的含量几乎增加了一倍，说明翻转是乌龙茶香气产生的关键阶段(图4D)。相比之下，儿茶素在不同加工点之间没有显示出倍数水平的含量变化，甚至有略微下降的趋势(图4E)。

此外，为了探索这些风味相关代谢物含量变化背后的转录调控机制，作者进行了三种加工叶的RNA-seq，发现萎凋和翻转过程均出现了大量的基因表达差异，尤其是翻转过程(2824个上调基因/5405个下调基因)(图4F)。这些差异表达基因可以有效解释加工过程中重要风味代谢产物的含量变化。萎凋叶和翻叶相较于茶叶上调的DEGs在单萜、二萜、萜主链生物合成和萜类代谢相关途径中显著富集(图4G)，与这两个过程中萜类的显著增加相一致。上调DEGs还在类苯丙烷类生物合成、异黄酮生物合成和脂质代谢途径中显著富集，下调的DEGs在类黄酮生物合成以及类黄酮和黄酮醇生物合成途径中显著富集(图4G)，这都解释了类黄酮和黄酮醇减少、脂质代谢物增加的事实。

图4. 乌龙茶采后加工中的DMs和DEGs

5、乌龙茶采后加工中5mC DNA甲基化模式

接下来，作者研究了采后加工过程中茶叶中5mC甲基化水平的变化。总的而言，基因富集的遗传区域显示出低的5mC甲基化水平，而转座子富集的区域显示出高的5mC甲基化水平(图5A)。样品相关性聚类和PCA清楚地将加工过的叶子(萎凋叶和翻叶)与未加工的新鲜叶子(茶叶)区分成两组，并且两种加工过的叶子倾向于聚类成一组，意味着加工引起了全基因组5mC甲基化水平的显著变化。茶叶中mCG、mCHG和mCHH的5mC甲基化水平分别为84.88、68.41和12.60%，并且所有三种类型的5mC甲基化水平在萎凋和翻转后显著更高(图5B)。此外，萎凋会导致CG和CHG型mC数量的少量减少和CHH型mC数量的少量增加，并增加了高水平mC的百分比；而翻转导致所有三种类型的mC的数量显著增加，伴随着高水平mC的百分比增加(图5C和D)。除此之外，萎凋和翻转两个加工过程导致在基因体区域及基因上下游区域的全基因组5mC甲基化水平显著增加，而TEs的全基因组5mC甲基化水平变化不显著，说明乌龙茶加工主要通过改变基因而不是TE的5mC甲基化水平来调节基因表达的变化。

图5. 乌龙茶三个重要加工点的单碱基分辨率5mC DNA甲基化谱

6、5mC甲基化参与采后加工中风味物质相关基因表达的上位性调控

为了进一步研究在加工过程中有差异5mC甲基化的基因及其对风味物质变化的潜在影响，作者进行了差异甲基化区域(DMR)和差异甲基化启动子(DMP)的鉴定。在萎凋叶vs茶叶中获得了总共15,836和19,047个高/低DMRs、146和75个高/低DMPs，并且在翻叶vs萎凋叶中获得了总共15,662和25,897个高/低DMRs、62和68个高/低DMPs(图6A)。CG型DMRs主要在基因上游1kb启动子区域内的分布、而CHG型DMRs在其他外显子和其他内含子区域的分布频率更高、至于CHH型DMRs则位于远端基因间区域(图6B)。意味着不同类型的5mC甲基化在基因不同区域的中起着偏好作用。

接下来，将在基因体区域或基因上游1.5 kb或下游0.5 kb与DMRs重叠的基因视为可能受5mC甲基化影响的基因，并结合基因差异表达的结果，获得确切的甲基化介导的DEGs。与茶叶相比，萎凋叶共获得259个高甲基化介导的下调基因(高下调基因)和389个低甲基化介导的上调基因(低上调基因)；而在翻叶vs萎凋叶中获得563个高下调基因和198个低上调基因(图6C)。根据KEGG注释的结果，这些DMR介导的DEGs负责脂质代谢、萜类化合物合成和类黄酮/异黄酮生物合成，意味着5mC甲基化在加工过程中风味物质含量的变化中起着关键作用(图6D)。

例如，橙花叔醇合酶基因(NES)(图6E)和α-法尼烯合酶基因(AFS1)在加工过程中由于低甲基化修饰介导了基因表达上调，从而导致萜类化合物的含量增加。4个异黄酮类相关合成基因在加工过程中甲基化降低，同时基因表达上调，而4个类黄酮相关合成基因的变化相反(图6D和F)，与黄酮类物质减少吻合。此外，由低甲基化介导的七种脂质代谢相关基因的上调表达与脂质含量的增加相一致(图6D)。这些发现表明，甲基化介导的基因表达在乌龙茶加工过程中香气和口感物质的产生中起着重要作用。

图6. 乌龙茶加工过程中的DMRs和DMR介导的DEGs

05   总  结   

总之，该研究整合DNA甲基化组、转录组和代谢组的多组学研究思路，不仅证明了5mC DNA甲基化参与冷胁迫和少量代谢物的合成，而且在茶树组织的功能分化及采前和采后的加工过程中重要风味物质(如茶氨酸、儿茶素和萜类化合物)的合成中发挥重要作用。研究结果为选育含高水平茶氨酸的茶树新品种及改良茶叶品质提供了潜在的靶点。

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